Aislamiento de células madre de tejidos blandos musculoesqueléticos

El objetivo general de este procedimiento es aislar células madre adultas de tejidos blandos músculo-esqueléticos, como el músculo esquelético. Esto se logra primero tomando una biopsia del tejido blando, desbridándolo y cortándolo finamente. El segundo paso del procedimiento consiste en digerir enzimáticamente el tejido.

El tercer paso del procedimiento consiste en aislar las células madre mediante pasos repetidos de preplaqueo. El paso final del procedimiento es la identificación de las células madre aisladas. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren el comportamiento morfológico y celular de las células mediante inmunofluorescencia, microscopía y/o citometría de flujo.

Hola, soy y Lee del Laboratorio de Patología Molecular del Departamento de Cirugía Ortopédica de la Universidad de Pittsburgh. Hoy les mostraré cómo aislar una célula madre adulta de los tejidos blandos del sistema esquelético de Mus, como el músculo esquelético. Hola, soy el Dr. Johnny Ward.

Soy profesor en la Escuela de Medicina de la Universidad de Pittsburgh, dentro del Departamento de Cirugía Ortopédica. He estado trabajando, digamos, estrechamente con el Dr. Young Lee en estos procedimientos para aislar, ya sabe, diferentes tipos de células madre del músculo esquelético y de tejidos adyacentes como el estándar. Utilizamos estos procedimientos en nuestro laboratorio para aislar células madre destinadas principalmente a estudios de investigación sobre aplicaciones en medicina traslacional.

Así que comencemos con el estudio. Los tejidos de los cuales se pueden aislar células madre incluyen tendones y músculos esqueléticos obtenidos de los músculos tibial o sóleo de la extremidad trasera de ratones de tipo silvestre. Después de eliminar los restos de piel y hueso, coloque los tejidos en un recipiente que contenga HBSS frío suplementado con 5 %FBS.

A continuación, coloque el tejido por separado en placas recubiertas con colágeno que contengan HBSS frío. Utilizaremos tejidos de músculo esquelético para demostrar los procedimientos básicos de disociación y digestión de tejidos. Use tijeras microquirúrgicas y/o hojas de bisturí para picar los tejidos esqueléticos hasta obtener una suspensión gruesa antes de la digestión enzimática de los tejidos.

Comience transfiriendo las suspensiones de tejido MIT a tubos separados de 15 mililitros e incube en centrífuga a aproximadamente 3.500 RPM a cuatro grados Celsius durante cinco minutos. Retire la solución SANE lavando con HBSS y repita la centrifugación. Después de eliminar el sobrenadante, digiera las suspensiones añadiendo 10 mililitros de colagenasa 0,2 % precalentada.

Incubar el tipo 11 durante 60 minutos a 37 grados Celsius, agitando los tubos a mano cada 10 minutos. Cuando finalice la incubación de 60 minutos, centrifugar y luego resuspender las suspensiones en 10 mililitros de solución DYS. Incubar durante 45 minutos a 37 grados Celsius, agitando a mano cada 10 minutos. Después de la incubación de 45 minutos, centrifugar y resuspender las suspensiones en 10 mililitros de solución de trips al 0,2 % en HBSS.

Normalmente incubamos de 15 a 20 minutos a 37 grados Celsius, invirtiendo los tubos cada 10 minutos, hasta que finalice la incubación. Cuando se hayan liberado suficientes células individuales de los tejidos, como se ilustra aquí, centrifugue las células resultantes y resuspenda el sedimento celular en cinco mililitros de medio de proliferación PM. Disocie la suspensión celular pasando el extracto a través de una serie de agujas: dos veces a través de una aguja de calibre 18, luego una vez a través de una aguja de calibre 23 y finalmente una vez a través de una aguja de calibre 27.

Por último, pase el extracto celular a través de un filtro celular de 70 micrones para comenzar la técnica prepl. Centrifugue el extracto celular que acaba de prepararse y re suspenda los pellet en medio de proliferación. Plaque cinco mililitros de la mezcla celular en un frasco T25 recubierto con colágeno y etiquételo como PP1, incubado a 37 grados Celsius en un incubador humedecido con 5% de dióxido de carbono durante dos horas.

Después de dos horas, transfiera las células no adherentes a un nuevo frasco T 25 recubierto con colágeno y etiquételo como PP dos. Añada cinco mililitros de PM al frasco T 25 anterior etiquetado como PP uno.

Devuelva ambos matraces al incubador durante 24 horas. Después de 24 horas, transfiera las células no adherentes del PP dos a un nuevo matraz T 25 recubierto con ENC de colágeno y márquelo como PP tres. Añada cinco mililitros de medio de proliferación al matraz etiquetado como PP dos.

Devuelva los frascos al incubador. Repita el procedimiento cada 24 horas hasta la población PP seis. Se crea la población de células madre.

Las células PP seis aisladas son muy escasas y deben mantenerse en un medio de proliferación rico en suero bovino fetal. Este medio se cambia diariamente. Aunque la mayoría de las células en el cultivo PP seis morirán durante la siguiente semana o dos de cultivo.

Una población grande y saludable de PP seis generalmente se crea después de una o dos semanas adicionales de expansión. Mantenga también todos los demás grupos de células en suspensión, permitiendo que proliferen y examinándolos regularmente mediante un microscopio invertido. Las células que se adhieren tempranamente y se fijan a los frascos de PP uno y PP dos son principalmente células fibroticas.

Células que se adhieren a frascos recubiertos con colágeno tras un período más prolongado dentro de las 48 a 96 horas. PP tres y PP cuatro son principalmente mioblastos. Aunque las células satélite musculares suelen observarse principalmente en PP cinco, las células prepl posteriores a las 96 horas o PP seis se consideran células madre adultas y presentan un aspecto pequeño, redondo y translúcido.

Al comienzo de su aislamiento, se pueden caracterizar adicionalmente mediante inmunohistoquímica por su expresión de marcadores de células madre, como la célula madre, el antígeno uno y CDC 34. Acabamos de mostrarle cómo aislar células madre a partir de una segunda masa del ratón. Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener los esteroides durante todos los pasos.

Una vez que se ha aislado la célula madre, asegúrese de cultivar esas células a baja densidad para mantener las características de células madre. Eso es todo. Gracias por ver este video y les deseamos buena suerte con su experimento. Les deseo éxito al intentar utilizar esto en su experimento.

Gracias.