Aislamiento de linfocitos T humanos, cultura y análisis de la migración In Vitro

La migración de linfocitos T ocurre durante la homing a órganos linfoides, la salida desde el sistema vascular y la entrada a tejidos periféricos. Este proceso implica la interacción adhesiva de la superficie del linfocito T con otras células. Para examinar este fenómeno in vitro, se aíslan linfocitos T humanos, se cultivan y se colocan en placas de cultivo celular recubiertas con la proteína adhesiva.

ICAM uno y quimiocina SDF uno. Luego se pueden adquirir y analizar imágenes de la migración de linfocitos T. Hola, soy Craig LeFort y del laboratorio de Minsu Kim en el Centro de Biología de Vacunas e Inmunología en la Universidad de Rochester.

Hoy les mostraremos un procedimiento para el aislamiento y cultivo de linfocitos humanos de adolescentes, así como un análisis de su migración in vitro. Utilizamos este ensayo en nuestro laboratorio para estudiar el papel de las integrinas y la migración de linfocitos T. La principal integrina en los linfocitos T es el antígeno asociado a la función linfocitaria uno o LFA-1.

Los ligandos específicos para LFA uno son las ICAS, como ICAM uno. Además, se requiere una señal quimiotáctica para la migración de linfocitos T, que proporciona tanto una señal de direccionalidad como la activación de integrinas. En nuestro ensayo, utilizamos ICAM uno humana y CX CL 12 o SDF uno como sustratos para la migración de linfocitos T.

Así que comencemos. Después de obtener sangre humana de un donante sano, deje que la sangre se enfríe a temperatura ambiente. Esto tarda aproximadamente 30 minutos.

Una vez que la sangre se haya enfriado, pipetee suavemente tres mililitros de medio de gradiente de densidad de polimorfo a temperatura ambiente en un tubo de poliestireno redondo de ocho mililitros. Luego, agregue suavemente tres mililitros de sangre total encima. Es importante evitar cualquier mezcla.

Coloque los tubos en una centrífuga y centrifugue a 500 G durante 45 minutos. A temperatura ambiente tras la centrifugación, las células mononucleares de la sangre periférica o PBMCs se han separado de los demás componentes sanguíneos. La capa de PBMCs aparece como la primera banda turbia desde la parte superior.

Bajo condiciones estériles, retire con cuidado y deseche la fase superior de color amarillo claro. Luego, utilice una micropipeta P1000 para transferir la capa de PBMC a un tubo cónico nuevo. Lave los PBMC dos veces con PBS, centrifugando las células a 500 G durante cinco minutos.

Cada vez que se realice la centrifugación, el sobrenadante estará algo turbio después de cada lavado. Re-suspender las células en 20 mililitros de medio RPMI 1640 que contenga 10% de FBS, 1% de penicilina-estreptomicina y un microgramo por mililitro de fitohemaglutinina o PHA. La incubación en presencia de PHA induce la activación y expansión de los linfocitos T.

Utilizando una pipeta, transfiera los PBMC a un matraz de cultivo T 75. A continuación, incube a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono durante una a 24 horas. Este paso permite separar los monocitos, que se adhieren a la superficie del matraz, de los linfocitos que permanecen en suspensión.

Tras la incubación, retire cuidadosamente todo el medio que contiene principalmente linfocitos y transfiéralo a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugue a 500 ×g durante cinco minutos. Suspender el sedimento celular en RPMI 1640 y transferir las células a un nuevo frasco T75 que contenga 25 mililitros de RPMI 1640 con FBS, penicilina, estreptomicina y PHA, e incubar a 37 grados Celsius.

Después de 24 horas de crecimiento, puede ser necesario agregar de 15 a 20 mililitros de medio fresco y transferir a un matraz T 175 más grande. Continúe la incubación durante tres días o dos días. Si la incubación inicial de las PBMC fue durante la noche después de tres días, utilice una pipeta para retirar el medio, que contendrá linfocitos en suspensión, y transfiera a un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugue a 500 G durante cinco minutos.

Reese ha sido el pellet celular y transfirió las células a un nuevo frasco T 75 que contiene 25 mililitros de RPMI 1640. Con FBS, penicilina, estreptomicina e IL humana dos o IL 15, coloque las células en el incubador. Si se inicia un frasco T 75, el cultivo necesitará expandirse y transferirse a un frasco T 175.

Después de uno a dos días, cultivar los linfocitos durante un total de cuatro a siete días. Un día antes del ensayo de migración, recubrir un plato con fondo de vidrio de 0,17 milímetros con 20 microgramos por mililitro de proteína A o G en PBS e incubar durante la noche a cuatro grados Celsius al día siguiente. Lavar el plato extensamente con PBS, luego añadir ICAM uno FC y SD F1 humano en solución de PBS al plato.

Incubar durante cuatro horas a temperatura ambiente para inmovilizar las moléculas. Determinar la densidad de las células cultivadas utilizando un hemocitómetro. Luego lavar los linfocitos dos veces con PBS y resuspenderlos en un mililitro de medio L-15 que contenga D-glucosa. Tras la incubación, lavar extensamente la placa recubierta con ICAM-1 FC y SDF-1 con PBS, transferir los linfocitos T en un mililitro de medio a la placa; aproximadamente de dos a cinco veces 10 a la quinta células deben utilizarse por placa para obtener una densidad celular adecuada para el análisis de migración.

Para obtener imágenes de la migración celular, coloque la placa sobre la platina del microscopio en un entorno controlado por temperatura, como una cámara calentada a 37 grados Celsius. Abra el software NIS Elements en el menú de configuración de imagen. Seleccione el modo de binning dos por dos tanto para la adquisición en vivo como para la captura de imágenes.

Vaya al menú de aplicaciones y seleccione definir, ejecutar, experimento. Elija la duración entre imágenes y el tiempo total. Para la secuencia de captura de imágenes, presione el botón de ejecución para iniciar la adquisición de imágenes tras la configuración.

Los parámetros de migración, como la velocidad, la longitud del recorrido y el desplazamiento, pueden cuantificarse mediante un paquete de software como Image J Auto Quant o veloc. Para generar un gráfico de telaraña, recopile las coordenadas XY de cada célula y punto temporal, y proyéctelas sobre un gráfico con un punto inicial común para cada célula en el origen. Los linfocitos T mostrados aquí se cultivaron sobre ICAM y SDF uno, y se capturaron imágenes cada 10 segundos durante 30 minutos.

Esta película muestra la migración aleatoria de linfocitos T a una velocidad de aproximadamente 15 micrones por minuto, utilizando las coordenadas XYT para cada célula. Se seleccionaron al azar 15 células y se representaron con un punto de partida común en el origen. La comparación de gráficos de araña proporciona una representación visual rápida de las diferencias en la migración entre distintas condiciones experimentales.

Los gráficos para la migración de linfocitos T bajo condiciones de control se muestran a la izquierda, mientras que los gráficos para la migración de linfocitos T en presencia de un anticuerpo bloqueante del ligando anti-LFA-1 se muestran a la derecha. Estos datos demuestran que los linfocitos T utilizan la integrina LFA-1 para migrar sobre un sustrato de ICAM-1. Acabamos de mostrarle cómo realizar un ensayo de migración utilizando linfocitos T humanos cultivados durante el procedimiento.

Es importante recordar agregar un número adecuado de células al platillo recubierto con ICAM uno para que el seguimiento celular y el análisis de la migración se simplifiquen. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.