La visualización y cuantificación de interacciones intracelulares de Neisseria meningitidis Humanos y α-actinina de imagen confocal

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar el grado de colocalización de las bacterias internalizadas, RIA Meningitidis, con la proteína del citoesqueleto alfa-actinina. Esto se logra infectando células microvasculares cerebrales humanas cultivadas con un cultivo bacteriano de sobrenocturno durante tres a ocho horas, para permitir que las bacterias ingresen a las células diana. Como segundo paso, las células con bacterias intracelulares se lavan, fijan y luego permeabilizan, lo que prepara el cultivo infectado para la inmunotinción de las bacterias internalizadas y de la alfa-actinina intracelular.

Tras la obtención de imágenes mediante microscopía confocal y la aplicación de software de colocalización, se pueden observar imágenes de la colocalización intracelular y obtener resultados cuantitativos que muestran que Meninga Croci que expresa OPC, así como también la proteína de membrana, puede interactuar específicamente con la alfa-actinina intracelular, según se evidencia mediante la visualización microscópica confocal y mediante análisis cuantitativo de colocalización. Hola, soy Isel María del laboratorio de la Profesora Mata TI, del Departamento de Medicina Celular y Molecular de la Universidad de Bri. Hoy les mostraré un procedimiento para la estimación del nivel de col, relación de bacterias intracelulares con proteínas del citoesqueleto.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar una interacción entre la meningitis micelial que expresa una proteína de membrana auto-OPC y la proteína del citoesqueleto alfa actina. Comencemos. Este trabajo debe realizarse en un laboratorio de seguridad adecuado.

Dos días antes del procedimiento de tinción inmunohistoquímica, inocule la cepa bacteriana de interés en agar de infusión cerebral cardíaca. Incube las placas de agar suplementadas con 10% de sangre de caballo calentada durante la noche a 37 grados Celsius en una atmósfera con 5% de dióxido de carbono el día anterior a la tinción inmunohistoquímica. Utilice un asa de cultivo de 10 µL para preparar una suspensión de la cultura bacteriana de crecimiento nocturno.

En dos mililitros de PBSB, deje que la suspensión repose durante cinco minutos a temperatura ambiente para permitir que los agregados bacterianos grandes se sedimenten. A continuación, transfiera el mililitro superior de la suspensión a un tubo estéril sin perturbar el sedimento, para solubilizar las bacterias agregando un mililitro de SDS al 1% y hidróxido de sodio 0,1 molar a dos viales que contienen 20 microlitros de suspensión bacteriana e invierta el tubo para mezclar. Para estimar el número de bacterias.

Mida el contenido de ácidos nucleicos determinando la absorbancia de la solución. A 216 anteras, ajuste la suspensión bacteriana a la densidad requerida en medio de infección para infectar las células endoteliales microvasculares humanas del cerebro. Las células endoteliales microvasculares humanas del cerebro o H-B-M-E-C-A sembradas dos días antes de la inmunotinción colocaron cubreobjetos de vidrio de 16 milímetros en los pocillos de una placa de 12 pocillos y siembre las HBME en 50 % de confluencia sobre los cubreobjetos; incube durante la noche a 37 grados Celsius en una atmósfera de 5 % de dióxido de carbono. Al día siguiente.

Infecte las células con la suspensión bacteriana recién preparada en nuestro laboratorio. Se utiliza rutinariamente una relación de infección de 200 a 300 unidades formadoras de colonias por célula diana. Incube de tres a ocho horas a 37 grados Celsius en un 5% de dióxido de carbono al final del período de infección.

Lave las células tres veces con PBS y fije con 500 microlitros de paraformaldehído al 2% durante 30 a 45 minutos a temperatura ambiente. Después de eliminar el paraformaldehído mediante lavados, permeabilice las células fijadas con paraformaldehído incubándolas en Tritón X-100 al 0,1% diluido en PBS durante 10 minutos. Finalmente, lave las muestras tres veces con PBS y continúe con la inmunotinción como se muestra. A continuación, la tinción de bacterias intracelulares y de actinina puede realizarse simultáneamente.

En placas de 12 pocillos, bloquee los cubreobjetos que contienen las células permeabilizadas con 500 microlitros de BSA-PBS-T al 3 % durante 30 a 60 minutos a temperatura ambiente. Después de lavar con PBS, transfiera cada cubreobjeto a un nuevo pocillo seco en la placa de 12 pocillos; agregue simultáneamente los anticuerpos primarios contra bacterias y alfa-actinina. Son suficientes 80 a 100 microlitros de anticuerpo por cubreobjeto, si se añaden cuidadosamente para cubrir toda la superficie del cubreobjeto. Incube durante una hora a temperatura ambiente. Al final de la incubación, agregue 200 microlitros de PBS al pocillo, levante el cubreobjeto y colóquelo en un nuevo pocillo que contenga 500 microlitros de PBS. Después de cinco minutos, retire el PBS mediante pipeta y agregue PBS fresco. Repita este lavado dos veces y transfiera los cubreobjetos a un nuevo pocillo seco.

A continuación, agregue los anticuerpos secundarios apropiados conjugados con diferentes fluorocromos, diluidos en 1 % de B-S-A-P-B-S-T. Incube a temperatura ambiente durante una hora en la oscuridad. Al finalizar la incubación, lave como se indicó previamente. Luego, contratiña el ADN con DPI durante cinco minutos a temperatura ambiente en la oscuridad. Al finalizar esta incubación, lave las cubreobjetos en PBS una vez y monte con una gota de medio de montaje. Las cubreobjetos montadas deben almacenarse en la oscuridad hasta que estén listas para su observación. Bajo el microscopio, observamos y capturamos imágenes de nuestras muestras inmunomarcadas utilizando un microscopio confocal de barrido láser acoplado a un microscopio invertido de epifluorescencia.

Para comenzar el procedimiento de microscopía confocal láser, coloque una gota de aceite de inmersión sobre el objetivo y coloque la cubierta del portaobjetos con la muestra, deslícela sobre la platina del microscopio, configure el microscopio en modo visual y localice el área de interés utilizando los oculares del microscopio. Ahora estamos listos para utilizar el software de Leica. Seleccione el modo de adquisición XY zed. Seleccione el formato cinco 12 por cinco 12 para estudios de colocalización.

Cuanto mayor sea la resolución, más precisa será la imagen. A continuación, seleccione el modo X bidireccional, lo que aumentará la velocidad de escaneo y ayudará a reducir el blanqueo fotográfico. Configure los ajustes de escaneo secuencial.

Haga clic en la función de SEC y luego seleccione entre líneas. Seleccione los haces láser según los fluorocromos conjugados a los anticuerpos secundarios. 405 nanómetros para DPI, 488 nanómetros para Alexa Fluor 488 y 561 nanómetros.

Para trixy, active el tubo fotomultiplicador uno, dos y tres, respectivamente. Configure la parte superior e inferior de la serie o pila Z. A continuación, establezca el tamaño del paso de Z en 0,2 micrómetros.

RIA Mencius es un diplococo y, dado que cada cápsula tiene un diámetro aproximado de 0,5 micrómetros, un tamaño de paso Z de 0,2 micrómetros aumenta la probabilidad de escanear cada cápsula al menos dos veces. Establezca los parámetros finales de escaneo seleccionando un promedio de línea de tres para mejorar la relación señal-ruido haciendo clic en iniciar. Se obtienen imágenes doble o triplemente marcadas mediante escaneo secuencial a diferentes longitudes de onda y utilizando el modo entre líneas para cada canal, con el fin de eliminar la interferencia entre los diferentes cromóforos.

Para obtener una indicación de la colocalización de dos fluorocromos, seleccione la función de superposición para combinar los canales seleccionados en una sola imagen. Por ejemplo, cuando ambos fluorocromos, Alexa 4 88 y trissy, colocalizan, aparecerá un color amarillo en la imagen superpuesta. Para una reconstrucción 2D necesaria para visualizar posibles colocalizaciones, compile la serie o pila Z utilizando la función de proyección máxima. Después de adquirir la pila Z o la serie, procese sus datos para obtener una imagen ortogonal que permita visualizar la localización intracelular de diversos elementos.

La cuantificación de la colocalización se realiza utilizando el software Vol City de IMP provision. Para comenzar, cree una biblioteca con imágenes de microscopía de barrido láser (CLSM) y seleccione enfoque extendido en la imagen de la barra superior. Esta herramienta combinará los planos Z en una imagen 2D para su análisis.

Ahora seleccione la herramienta de COLocalización. Los dos canales que se van a analizar deben tener la misma profundidad de color. Seleccione el área que se va a cuantificar.

Establezca el umbral para eliminar cualquier fondo. Cree la salida de colocalización seleccionando generar colocalización. Se generarán estadísticas de colocalización para las regiones de interés seleccionadas previamente.

A continuación, seleccione los coeficientes de Mander R y ny. Finalmente, exporte los valores estadísticos a un documento de Excel para la presentación de datos; aquí se muestran resultados representativos de imágenes confocales de células endoteliales cerebrales humanas infectadas con meninga cockeye durante ocho horas. La ubicación de las bacterias se muestra en rojo.

Aunque la ubicación de la alfa-actinina se muestra en verde, las flechas indican regiones donde parece haberse producido una alta acumulación de alfa-actinina alrededor de las bacterias. En esta imagen superpuesta, existen varias regiones con color amarillo anaranjado, lo que sugiere una colocalización entre *meningococo* y la alfa-actinina. En esta siguiente imagen, el corte óptico de una monocapa de H-B-M-E-C infectada indica colocalización alrededor de bacterias intracelulares localizadas en la base de una célula.

Cuando se procesaron imágenes tridimensionales de monocapas de H-B-M-E-C infectadas, una vista oblicua de la superficie apical muestra una bacteria Durant teñida de rojo, indicada por la flecha roja, donde varias bacterias se localizan hacia las superficies basales de las células endoteliales, indicadas por la flecha amarilla. Una ubicación basal de color naranja, amarillo, se puede observar con mayor claridad en esta sección transversal XZ de endon. En contraste con experimentos lejanos de actinina, en los que se realizó la marcación de bacterias internalizadas y de mentona o actina, se revela una colocalización ocasional con actina, pero rara colocalización con fermentación en células H-B-M-E-C.

Como se observó en los experimentos previos, la retina se concentró alrededor de varias bacterias internalizadas indicadas por las flechas blancas. Los datos también se analizaron para obtener el grado relativo de superposición. El coeficiente R, que según Manda representa el verdadero grado de colocalización IE, es decir, el número de píxeles que colocalizan en comparación con el número total de píxeles, y los valores NY para alfa-actinina, menting y actina en general en H-B-M-E-C infectadas con meningococos que expresan OPC, mostraron una superposición de retin con meningococos mayor al 25 %.

El coeficiente y Y es una medida de la frecuencia de una señal de moneda más abundante cada vez que ocurre la señal de meninga cocoa menos abundante. Esta medida muestra un nivel notable de aparición de alfa-actinina en las proximidades de la meninga cockeye internalizada. Aquí le mostramos cómo visualizar y cuantificar la introducción de bacterias internalizadas junto con elementos del citoesqueleto dentro de este experimento.

Es importante recordar seguir estrictamente los protocolos de fijación e inmunomarcado para mantener la integridad de las estructuras y evitar un fondo elevado. Eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.