Respuesta de células vivas a la estimulación mecánica estudiados por microscopía óptica integrada la Fuerza Atómica y

El estudio de la respuesta celular en tiempo real a la estimulación mecánica se lleva a cabo primero cultivando células que expresan proteínas de fusión GFP en placas con fondo de vidrio durante 24 horas. El segundo paso consiste en recubrir la punta de microscopio de fuerza atómica (AFM) con fibronectina biotinilada. Luego, la punta de AFM funcionalizada se pone en contacto con la superficie celular para permitir la formación de una adhesión focal fuerte alrededor de la punta de AFM, lo que permite la manipulación directa del citoesqueleto de actina mediante un enlace entre la matriz, las integrinas y la actina, entre la punta recubierta de fibronectina y la célula.

El paso final consiste en estimular mecánicamente la célula viva mediante un movimiento ascendente controlado de la punta de microscopía de fuerza atómica (AFM), de modo que la fuerza vertical se aplique en el punto de contacto con la célula sin romper la adhesión focal fuerte. En última instancia, los resultados muestran que las células responden a la estimulación mecánica reforzando su adhesión al sustrato e induciendo la reorganización del citoesqueleto de actina, tal como se registra mediante imágenes ópticas de fluorescencia en tiempo real. Hola, soy Andrea Trake, profesora asistente del Departamento de Biología de Sistemas y Medicina Traduccional en el Centro de Ciencias de la Salud Texas A&M.

Hola, soy Sum Lim. Soy investigador posdoctoral en el Departamento de Biología de Sistemas y Medicina Traduccional del Centro de Ciencias de la Salud de Texas A&M. Hoy les mostraremos un procedimiento para estudiar la reestructuración celular adaptativa ante la estimulación mecánica.

Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para investigar en tiempo real la remodelación del citoesqueleto en células vivas de músculo liso vascular. Así que comencemos. Para estos estudios, se utiliza un microscopio invertido Olympus IX 81 con un sistema de fluorescencia por reflexión interna total o accesorio TIRF, combinado con una cabeza de escaneo CSU 22 de Yokogawa.

Un microscopio de fuerza atómica tipo bio scope SZ está montado encima de un microscopio óptico invertido. Todo el sistema está colocado sobre una mesa óptica de investigación y ha sido descrito previamente en detalle. Este microscopio integrado utiliza dos cámaras electrónicas multiplicadoras de carga acopladas, también conocidas como EM-CCD.

Uno es para imágenes de césped y el otro para imágenes confocales. El conjunto confocal, que consta del escáner de disco giratorio, rueda portafiltros externa y una cámara E-M-C-C-D, está montado sobre una placa base de aluminio colocada encima de una almohadilla de silicona necesaria para la amortiguación de vibraciones. Todo el conjunto confocal se conecta al microscopio mediante una brida con un collar roscado.

Por lo tanto, el ensamblaje puede desacoplarse del microscopio durante la microscopía de fuerza atómica o mediciones de FM para evitar vibraciones provenientes del escáner de disco giratorio. Se utiliza un láser de argón criptón como fuente de excitación tanto para el modo de imagen de turf como para el modo confocal. El láser puede acoplarse a cualquiera de las dos fibras ópticas, que dirigen el láser al accesorio de turf o a la cabeza de escaneo confocal.

Dos computadoras controlan el sistema. Una utiliza un software de libro de diapositivas, que controla la imagen óptica, y la otra un software de nanoscopio, que controla el AFM. Veinticuatro horas antes del experimento de estimulación mecánica, coloque células vivas que expresan constructos GFP dirigidos contra proteínas específicas en un platillo de cultivo celular con fondo de vidrio. En el día del experimento, reemplace el medio de cultivo celular con un medio libre de rojo de fenol.

Dado que un experimento de MF es muy sensible al ruido, evite hablar o tocar la mesa óptica o el microscopio durante el experimento para minimizar el ruido. En las mediciones de MF, desacople el disco giratorio confocal del microscopio. El experimento comienza colocando el recipiente de cultivo celular sobre la platina de MF con un collar magnético para fijar el recipiente a la platina magnética del microscopio.

El cantiléver en forma de V en la sonda de FM está personalizado con la microperla de vidrio biotinilada. El cantiléver puede verse fácilmente mediante el microscopio. La perla está pegada en el extremo mismo del cantiléver, y aquí es donde se debe aplicar gota a gota la solución de recubrimiento.

Para preparar una sonda FM para el experimento, primero monte la punta en el soporte de vidrio y luego coloque el soporte de vidrio en el soporte de la mesa para recubrir la punta. Lave la punta dejando caer cuidadosamente 10 microlitros de solución salina tamponada con docos fosfato o DPBS en el extremo mismo de la punta, y luego use una toallita kim para secar la punta. Repita este procedimiento cinco veces después de lavar con DPBS a una concentración de un miligramo por mililitro.

Agitación en solución. Añadir gota a gota sobre la punta. Dejar que la punta incube durante cinco minutos tras el recubrimiento con avadon.

Lave la punta cinco veces más con DPBS. A continuación, reticule la fibronectina biotinilada sobre el avadón añadiendo una solución de un miligramo por mililitro, gota a gota sobre la punta e incubando durante cinco minutos.

Finalmente, lave nuevamente la punta cinco veces con DPBS, dejando la última gota en la punta. Una vez que la punta haya sido preparada, coloque la punta en un escáner de FM. Después de colocar la punta de FM, coloque una falda protectora de silicona alrededor del soporte.

Luego configure el microscopio para la visualización de video. A continuación, alinee una punta de FM en el centro del campo de visión. Establezca la palanca óptica colocando el haz láser en el extremo mismo del cantiléver.

Luego, cambie el objetivo al objetivo de alta magnificación adecuado para la imagen individual de células. A continuación, coloque la célula, que será estimulada mecánicamente, en el campo de visión y elija un lugar donde la punta de FM deba posarse sobre la superficie celular. Finalmente, baje la punta de FM hasta que haga contacto con esa célula específica.

Después de poner la punta en contacto con la célula, espere aproximadamente 20 minutos. Esto permite que se forme una adhesión focal fuerte en el punto de contacto de la MF sobre la superficie celular. Tras el período de espera, puede comenzar el procedimiento de estimulación mecánica para preparar el experimento de estimulación mecánica.

Cambie de cámara de video a cámara E-M-C-C-D para permitir la visualización de las células fluorescentes durante la obtención de imágenes. Luego, adquiera una imagen inicial de la célula en reposo. Utilice microscopía de disco giratorio y microscopía vocal para la visualización del citoesqueleto de actina en todo el cuerpo celular.

Por el contrario, utilice el césped para visualizar las adhesiones focales y estimular la célula. Utilice el cantiléver para aplicar un movimiento controlado hacia arriba en pasos discretos cada tres a cinco minutos. Durante la adquisición de los datos de microscopía de fuerza atómica (AFM), es importante que el operador supervise constantemente el voltaje de la posición Z del piso para determinar el momento adecuado para el polo vertical.

Simultáneamente a la adquisición de datos de FM, registre una imagen confocal o de mosaico de la célula después de cada tracción vertical utilizando el software Slide Book. Finalmente, retire la punta de FM de la célula al completar el experimento de estimulación. Una célula de músculo liso vascular transfectada con actina MRFP y vcul.

Se realizó la imagen de GFP mediante un microscopio de fluorescencia (FM) en la superficie apical de la célula. La misma célula fue imagen mediante turf en la superficie basal de la célula. Aquí se superponen las dos imágenes.

Se adquirió también una imagen de la misma célula mediante microscopía confocal de disco giratorio a lo largo de todo el cuerpo celular, y se muestra como una proyección máxima de un conjunto tridimensional. Se observa una buena superposición entre las imágenes de MF-A y las imágenes confocales de disco giratorio. Esta célula de músculo liso vascular transfectada con actina MRFP fue estimulada mecánicamente mediante la MF-A e imagenada por microscopía confocal de disco giratorio.

Los errores indican fibras de actina que muestran una notable reestructuración tras una estimulación de FM. Algunas fibras de actina se polimerizan mientras que otras se despolimerizan debido a la estimulación mecánica; otras fibras de actina se agrupan en haces. Debido a la reestructuración de la actina, acabamos de mostrarle cómo estimular mecánicamente una cultura de células vivas utilizando EFM mientras se registra simultáneamente la reorganización del citoesqueleto mediante métodos de imagen óptica.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar que un experimento de FM es extremadamente ruidoso y sensible. Eso es todo. Gracias por verlo y buena suerte con sus mediciones.