Un método para el aislamiento de los islotes murinos y Trasplante Renal subcapsular

El trasplante de islotes pancreáticos se ha propuesto como un tratamiento potencial para la diabetes tipo uno. Sin embargo, dos limitaciones importantes impiden que se convierta en una realidad clínica generalizada. En primer lugar, se necesita un gran número de islotes por receptor.

Dado que los islotes se obtienen de donantes de órganos, el número de receptores potenciales está severamente limitado. El trasplante secundario requiere un tratamiento de por vida con inmunosupresores potentes, lo que pone al paciente, especialmente a la población pediátrica, en riesgo de desarrollar malignidades, infecciones e insuficiencia renal. El trasplante de islotes bajo la cápsula renal del ratón se realiza para investigar estrategias que mejoren los resultados del trasplante clínico.

Islotes aislados de ratones donantes sanos se agrupan en grupos y se preparan para trasplante. Luego, los islotes se trasplantan al espacio subcapsular del riñón. En ratones receptores diabéticos, la función del injerto de islotes se evalúa mediante el monitoreo de los niveles de glucosa en sangre, lo que revela que aproximadamente entre 250 y 350 islotes restaurarán la euglicemia en un ratón receptor de 20 gramos dentro de las 24 horas posteriores al trasplante.

La demostración visual de este método es fundamental respecto a los pasos para la canulación. Es difícil aprender la identificación del conducto biliar común y la transferencia de los ojetes al espacio subcapsular del riñón. Estos pasos requieren la identificación de estructuras tisulares, manos firmes y el uso de una técnica que minimice el daño tisular.

Coloque un ratón sacrificado en posición supina sobre una toalla de papel bajo el microscopio de disección y rocíe el abdomen con etanol al 70%. Use tijeras para abrir el abdomen con una incisión en forma de V desde la región púbica hasta las dos patas delanteras. El ratón se encuentra debajo del microscopio de disección.

Colóquelo con la cabeza orientada hacia el observador. Localice la entrada duodenal del conducto biliar común con una pinza hemostática, la abertura duodenal del conducto biliar común. La pinza hemostática debe colocarse de manera que, al comprimirse, siga exactamente el borde entre el páncreas y el intestino.

Aquí se demostrarán dos métodos para canular el conducto biliar. El método de mano libre y el método con ayuda de fórceps para canular el conducto biliar. Utilizando el método de mano libre, tire del hemostato sujeto al duodeno alejándolo de la cabeza del ratón hacia la cola, de modo que el conducto biliar común quede tenso.

Existe una confluencia en el conducto biliar cerca del hígado donde se unen la bilis que drena desde la vesícula biliar y las enzimas provenientes del hígado. Antes de entrar en los intestinos, tense el conducto biliar para exponer el interior de la posición en forma de V. Utilice una aguja curvada de calibre 27 conectada a una jeringa de cinco mililitros, de modo que la aguja atraviese justo la posición en V y canule directamente la porción inferior del conducto. Deslice la aguja varios milímetros más allá del extremo del bisel para evitar el reflujo hacia el hígado y la vesícula biliar.

Una vez que la canulación sea exitosa, perfundir el páncreas dispensando dos mililitros de liasa desde la jeringa. Observar la expansión del páncreas sobre el estómago como indicación de una canulación óptima. Alternativamente, se puede canular el conducto biliar.

Utilizando el método de la fórceps quística. Tire del hemostato C sujeto al duodeno alejándolo de la cabeza del ratón hacia la cola, de modo que el conducto biliar común se tense. Luego, utilizando una aguja curvada de calibre 27 conectada a una jeringa de cinco mililitros, punzón la fascia por debajo del conducto biliar común cerca del hígado.

Utilice la aguja para separar la fascia del conducto con la aguja aún en su lugar. Deposite el hemostato y tome un par de pinzas. Use un brazo de las pinzas abiertas para sostener el conducto biliar en el lugar donde la aguja ha separado la fascia, mientras tira del conducto y las pinzas hacia adelante.

Deslice la aguja dentro del conducto utilizando la pinza como tope. Una canulación exitosa se indica por una expansión uniforme de la región del páncreas situada encima del estómago. Una vez que se haya perfundido el páncreas, retire el hemostato del duodeno.

Luego, use la pinza para levantar el duodeno y utilice un segundo par de pinzas para separar el páncreas de los intestinos. A continuación, tire del páncreas para separarlo de la parte superior del estómago y del bazo. Finalmente, levante el páncreas fuera del abdomen y córtelo para separarlo de las conexiones restantes de la fascia con el intestino, el estómago y el bazo.

Coloque el páncreas en un tubo cónico de 50 mililitros y colóquelo en hielo. Incube el páncreas a 37 grados Celsius según las instrucciones del protocolo escrito adjunto. Después de la incubación, agregue 20 mililitros de medio a los tubos y disocie el tejido agitando los tubos vigorosamente 40 veces en 10 segundos.

Este paso es fundamental para una recuperación óptima de las violetas. Centrifugar las células a 800 rotaciones por minuto. Re-suspender en 15 mililitros de medio y concentrar las muestras.

Vierta la suspensión a través de una malla de alambre de 0,419 milímetros y diríjala hacia un tubo cónico nuevo de 50 mililitros. Enjuague el primer tubo con 10 mililitros adicionales de medio que contenga 10% de suero bovino fetal y viértalo a través de la malla de alambre. Pelletee las células mediante centrifugación, redispersa el precipitado en cinco mililitros de medio Hís Opaco 10 77 a temperatura ambiente. Luego, vortexee suavemente durante varios segundos, agregue cinco mililitros adicionales de Hís Opaco alrededor de la parte interna del tubo para lavar los restos adheridos a la pared del tubo. Pipetee lentamente para superponer 10 mililitros de RPMI libre de suero por la pared del tubo a una velocidad de un mililitro por cada 10 segundos.

Debe observarse una interfaz nítida. A continuación, centrifugar las muestras en una centrífuga con rotor de cestas oscilantes a 20 grados Celsius y 900 veces la gravedad durante 20 minutos, con una aceleración muy lenta y sin frenado tras la centrifugación. Las islitas se separarán de las células exocrinas utilizando una pipeta serológica desechable de 10 mililitros. Transferir las islitas desde la interfaz del medio histo Paque a un tubo cónico nuevo de 50 mililitros.

En este punto, se pueden agrupar varios tubos para eliminar el residuo de los orificios, rellenar los tubos opacos con medio que contenga suero y centrifugar los tubos durante dos minutos a 800 rotaciones por minuto para obtener el pellet de islotes. Luego, volver a suspender los islotes en medio fresco. Repetir este paso al menos dos veces.Reus.

Suspenda el pellizco en cinco mililitros de medio. Coloque un filtro de células de nailon de 0.1 milímetros boca abajo sobre un tubo cónico de 15 mililitros. Pase la suspensión celular mediante pipeta a través del filtro para recolectar los orificios.

Luego, enjuague el tubo de 50 mililitros con seis mililitros adicionales de medio y páselos a través del filtro. Coloque una gota de tres mililitros de medio en una placa de Petri de 10 centímetros. Invierta el filtro celular y sumérjalo en la gota de medio para recoger los orificios; pipetee cinco a siete mililitros adicionales de medio de cultivo a través del filtro hacia la placa de Petri.

Para recoger los orificios restantes del colador bajo un objetivo de cuatro aumentos, tome los orificios individualmente con una pipeta P200 y transfiéralos a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros. Estas imágenes muestran orificios aislados de ratones C57BL/6 de 12 semanas de edad. La pureza y calidad de los orificios pueden estimarse microscópicamente al finalizar el procedimiento de aislamiento.

Por ejemplo, las dos imágenes mostradas aquí muestran un campo representativo donde hay presencia de restos celulares y contaminación por células exocrinas. Al seleccionar islotes para un experimento, evite escoger células exocrinas contaminantes o islotes que parezcan estar en mal estado. Los islotes con centros necróticos se encuentran en mal estado, como se muestra en esta figura tomada 24 horas después del aislamiento; los centros necróticos no serán visibles inmediatamente después del aislamiento.

Los orificios que son células descamadas son inevitables y pueden utilizarse en trasplantes de orificios, como se observa en este video de lapso de tiempo de 24 horas. Inmediatamente después del aislamiento, se desarrollan centros necróticos dentro de muchos de los orificios. Estos centros necróticos parecen ser expulsados del orificio cerca del final de la grabación, durante la selección de los orificios.

Agrúpelos de manera que cada tubo tenga una distribución equilibrada en cuanto a calidad y tamaño de los ojales. Por ejemplo, cada grupo de 15 ojales podría contener cuatro ojales grandes, seis ojales medianos y cinco ojales pequeños. Coloque el tubo en hielo; los ojales pueden usarse inmediatamente para trasplante o pueden manipularse.

Antes de usar. Coloque una punta estéril para carga de geles en la abertura de un tubo microfusible de 1,5 mililitros de manera que se forme una curva suave, creando una forma de U en el extremo estrecho de la punta. Ambas aberturas de la punta deben quedar orientadas directamente hacia arriba, fuera del tubo microfusible.

Retire suavemente un tubo de ojales del hielo. Asegúrese de que todos los ojales se hayan sedimentado en el fondo del tubo. Utilizando una pipeta P200, recoja suavemente los ojales en un volumen mínimo desde el fondo del tubo y transfiéralos a la punta curva preparada.

Una vez que los ojetes hayan sedimentado, retire la mayor cantidad posible de medio de la punta aspirando el medio a través de la abertura grande de la punta para carga de geles que contiene los ojetes, utilizando una punta para carga de geles nueva conectada a una pipeta P200. Conecte el extremo no biselado del tubo a la abertura estrecha de la punta para carga de geles que contiene los islotes. Luego, conecte la punta a una pipeta P200 y empuje suavemente los islotes dentro del tubo.

A continuación, conecte el extremo no biselado del tubo PE 50 a la aguja de una jeringa Hamilton de 25 microlitros. Con el émbolo retirado, presione el émbolo de la jeringa hasta que los ojales estén aproximadamente a 0,5 centímetros de la abertura biselada. Coloque la jeringa a un lado para que los ojales se asienten en una sola masa cerca de la abertura biselada del tubo mientras se prepara el riñón para recibir los ojales.

Prepare el sitio quirúrgico cortando el pelo y frotando la piel con Betadine alternando con alcohol isopropílico al 70 % tres veces. Comience el procedimiento de trasplante del ojal realizando una compresión en el dedo del pie para confirmar la anestesia en el ratón receptor. Coloque el eje de una varilla de vidrio directamente debajo del ratón y por debajo del riñón, perpendicular a la médula espinal.

Luego, localice el riñón a través de la piel y coloque un campo quirúrgico estéril. Una vez localizado el riñón, use tijeras McFerson banis para hacer una incisión de dos centímetros a través de la dermis directamente encima de él, perpendicular a la médula espinal. Esta incisión expondrá la pared peritoneal con las tijeras.

Realice una incisión de un centímetro a través de la pared peritoneal en la misma dirección que el corte a través de la capa dérmica, utilizando el eje de la varilla de vidrio como tope, y fuerce el riñón a través de la abertura peritoneal presionando hacia abajo sobre la superficie adyacente. Humedezca la superficie del riñón expuesto con PBS estéril frío con hielo utilizando un aplicador de algodón humedecido. Repita el paso cada pocos minutos según sea necesario para evitar que la cápsula del riñón se seque.

Con una aguja de 27 gauge, realice una incisión de 0,2 centímetros a través de la cápsula renal a lo largo de la superficie anterior del riñón. Desplazándose desde el lado lateral izquierdo hacia el lado lateral derecho, inserte un tubo capilar de vidrio estirado con llama. Introduzca el tubo a través de la incisión realizada previamente y muévalo en dirección posterior a lo largo de la superficie lateral dorsal del riñón.

Para crear una bolsa entre la cápsula renal y el parénquima renal, mueva los orificios en la jeringa Hamilton de 25 mililitros preparada hasta el borde extremo de la abertura biselada del tubo flexible. Luego inserte el borde biselado con la cara hacia arriba en la bolsa subcapsular. El borde largo está en contacto con el parénquima renal.

Mueva el tubo hasta el extremo más posterior de la cápsula. Luego, transfiera lentamente los ojales desde el tubo de PE 50 al interior del saco subcapsular presionando el émbolo de la jeringa. A medida que los ojales llenan el saco, retire lentamente el tubo flexible para crear más espacio.

Tras retirar el tubo del saco, deslice la sonda de vidrio a lo largo de la superficie externa del riñón, de anterior a posterior, para empujar suavemente las aberturas hacia el extremo proximal del saco. Utilizando fórceps de brazo curvado, levante el revestimiento peritoneal adyacente a la abertura hecha para el riñón. Luego, use un aplicador de algodón humedecido con PBS para empujar suavemente el riñón de vuelta hacia la cavidad peritoneal.

Cierre el ratón aplicando suturas en la pared peritoneal y grapas quirúrgicas en la capa dérmica. Devuelva el ratón a su jaula y realice un monitoreo. Para la recuperación, se debe proporcionar agua con acetominofeno para el intestino del ratón.

Ojitos de ratón C aislados. Utilizando los métodos descritos en este video, se trasplantó una dosis curativa en ratones C57BL/6 alogénicos. Se monitorearon los niveles de glucosa en sangre sin ayuno a partir del día uno posterior a la cirugía.

El rechazo se observa alrededor del día 17 en ratones receptores de 20 gramos que recibieron 300 islotes de un donante alogénico aquí. La recuperación se monitoreó en ratones que recibieron ya sea 150 islotes o 300 islotes de donantes singénicos. No se observa rechazo en estos trasplantes, ya que los islotes provienen de donantes singénicos.

La dosis de islotes administrada mide la función principal de los islotes inmediatamente después del trasplante. Si bien se observó una recuperación marginal con 150 islotes, se observó una recuperación completa cuando se trasplantaron 300 islotes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar los pasos críticos necesarios para aislar los islotes de ratón y trasplantarlos en el espacio subcapsular del riñón.

Con la práctica, desarrollará la capacidad de cateterizar rápidamente el conducto biliar común, que es el paso más difícil de este protocolo.