Análisis de todo el genoma con chip para identificar objetivos específicos para cada isoforma Gene

El objetivo general del siguiente experimento es identificar los blancos genómicos de KDM cinco a Jared uno, una histona desmetilasa RBB dos. Esto se logra mediante la preparación de cromatina reticulada que se sonicada para producir fragmentos de ADN del tamaño adecuado como segundo paso. Los fragmentos de ADN unidos a RBB dos se inmunoprecipitan con anticuerpos contra RBB dos.

A continuación, el ADN genómico recuperado se amplifica mediante PCR para su secuenciación. Finalmente, las lecturas cortas secuenciadas por Illumina se alinean de manera única al genoma humano, y se identifican picos significativos que se anotan a los genes más cercanos. Con el fin de identificar los dos genes diana de Rbbb, se obtienen resultados que muestran funciones moleculares asociadas con los genes diana de Rrb B dos, basándose en la identificación a nivel del genoma completo de regiones enriquecidas para Rbbb dos.

Hola, soy Mike. Ella del laboratorio de la Dra. Elizabeth Bencia en el Departamento de Bioquímica y Genética Molecular de la Universidad de Illinois en Chicago. Y soy ala del laboratorio de genómica biomédica dirigido por la Dra. NGA en el Parque de Investigación Biomédica BARCEL de la Universidad PO P fea.

Y yo soy Danielle Dal. Y yo soy William Richter. Ambos también estamos en el Laboratorio de Habilidades de Benevolencia.

Hoy les mostraremos un procedimiento para la inmunoprecipitación y secuenciación de cromatina. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar el sitio de unión de su dermatólogo. Así que comencemos.

Para comenzar este procedimiento, cultive aproximadamente 10 a la octava potencia de células por cada inmunoprecipitación o IP. Aquí, linfoma osteolítico difuso.

Se utilizan células U 937 y se inducen para la diferenciación monocítica con TPA durante 96 horas tras el crecimiento celular. Añada directamente solución de formaldehído al medio hasta alcanzar una concentración final de 1 %. A continuación, agite brevemente el frasco y déjelo reposar a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego aspire el medio y enjuague las células con 15 mililitros de PBS frío con hielo. Repita este lavado una vez.

A continuación, agregue seis mililitros del tampón de lisis uno a cada uno de los frascos sobre hielo. Luego, agite suavemente los frascos durante 20 minutos a cuatro grados Celsius. Finalmente, recoja las células utilizando un raspador celular y transfiéralas a tubos cónicos de 15 mililitros.

En este momento, las células pueden almacenarse a menos 80 grados Celsius. Si las células fueron congeladas, déselas. Una vez descongeladas, centrifugue las células y deseche el sobrenadante.

Luego, resuspenda las células en seis mililitros de tampón de lisis dos y agite suavemente los tubos a temperatura ambiente durante 10 minutos. Repita la centrifugación y resuspenda las células en 2,5 mililitros de tampón de lisis tres. A continuación, prepare la suspensión para la sonicación colocándola en un vaso con agua helada, utilizando la micropunta de un sonificador Branson 450 ajustado a una amplitud entre 50 y 60 %.

Sonicar la solución durante una ráfaga constante de 32 segundos y enfriar en hielo. Durante un minuto, repetir estos pulsos de 10 a 15 veces, luego pipetear el contenido del tubo hacia arriba y hacia abajo y transferirlo a un tubo nuevo. Continuar pulsando y enfriando la solución.

Cinco veces adicionales tras la sonicación, añada Triton X-100 al 10 % a un décimo del volumen de la solución. Luego transfiera los lisados a tubos de centrífuga de 1,5 mililitros y centrifugue para eliminar los residuos en una microcentrífuga antes de la inmunoprecipitación de cromatina o el análisis por chip. Guarde 50 microlitros del lisado celular como la muestra de entrada.

Luego, combinar el lisado celular clarificado con perlas Dyna unidas a anticuerpo que se habían preparado previamente según se describe en el protocolo escrito. Agitar la mezcla junto con la muestra de entrada de 50 microlitros a cuatro grados Celsius durante la noche. Lavar las perlas con un mililitro de tampón de lavado.

Luego, use un soporte magnético para recoger las perlas y elimine el sobrenadante. Repita este lavado de seis a ocho veces. Realice un lavado final con un mililitro de TE más 50 milimolares de cloruro de sodio.

Centrifugar las perlas en una microcentrífuga tras la centrifugación y aspirar cualquier tampón TE residual. A continuación, añadir 100 microlitros de tampón de elución a las muestras. Inmediatamente después.

Incube las muestras a 65 grados Celsius durante 10 a 15 minutos. Raspe los tubos contra un soporte para tubos de 1,5 mililitros cada dos minutos para mantener las perlas en suspensión. Recopile las perlas mediante centrifugación y el soporte magnético y transfiera el SNAT a un tubo de PCR.

Luego, recupere la muestra de entrada previamente guardada y agregue tres volúmenes del tampón de elución. Finalmente, coloque las muestras de IP y de entrada en el termociclador durante la noche a 65 grados Celsius. Al día siguiente, para revertir los enlaces cruzados, agregue un volumen de tampón TE a las muestras.

Luego, agregue ARN A hasta una concentración final de 0,2 microgramos por microlitro. Incube las muestras en el ciclador térmico durante una a dos horas a 37 grados Celsius. Tras la incubación, agregue proteinasa K hasta una concentración final de 0,2 microgramos por microlitro.

A continuación, incubar las muestras en el termociclador a 55 grados Celsius durante dos horas. Luego, extraer las muestras una vez con un volumen de fenol. Extraer las muestras una segunda vez con un volumen de fenol cloroformo alcohol isoamílico.

Finalmente, extraiga las muestras una vez más con un volumen de cloroformo-isoamil alcohol. Luego, agregue 30 microgramos de glicógeno a cada muestra. Además, agregue cloruro de sodio hasta una concentración final de 0,2 molar y dos volúmenes de etanol a las muestras.

Incubar durante 30 minutos a menos 80 grados Celsius. Después de la incubación, centrifugar las muestras y decantar el sobrenadante. Lavar los pellet con 500 microlitros de etanol al 75%, luego secar los pellet y resuspenderlos en 40 microlitros de agua.

Para verificar el tamaño de los fragmentos de ADN producidos por el procedimiento de SONICACIÓN, cargue cinco microgramos de la muestra de entrada purificada en un gel de agarosa al 1,8 % y corra el gel. El procedimiento de sonicación debe producir fragmentos en un rango de 150 a 350 pares de bases. Sin embargo, si los fragmentos no se encuentran dentro de este rango, el procedimiento de sonicación debe ajustarse variando el número de ráfagas y la amplitud antes de la amplificación del ADN genómico.

Verifique el tamaño, la concentración y el enriquecimiento de las muestras según se describe en el protocolo escrito. Para iniciar la amplificación del ADN genómico, obtenga 34 microlitros de la muestra de IP y 200 nanogramos de la muestra de entrada. Realice y repare la adición de cola y la ligación de adaptadores a los fragmentos de ADN utilizando un kit de preparación de muestras de ADN genómico de Illumina según se describe en el protocolo escrito.

Purifique el ADN utilizando un kit de purificación de PCR en mini columna y luego elúyalo en tampón EB que se ha precalentado a 50 grados Celsius. Utilice 23 microlitros y 46 microlitros para las muestras de ADN de IP y de entrada, respectivamente. Realice la reacción de PCR usando 23 microlitros de ADN con los adaptadores, 25 microlitros de fusión y la ADN polimerasa del kit.

Un microlitro de PCR único de 20 micromolar y un microlitro de PCR dos de 20 micromolar. Realice la reacción de PCR según se describe en el protocolo escrito. Tras la amplificación por PCR, purifique el ADN con el kit de purificación de PCR Qiagen mini loop.

Caliente previamente 15 microlitros del tampón EB a 50 grados Celsius y diluya el ADN diluyendo 0,5 microlitros de la muestra de uno a cuatro y realice una lectura en NanoDrop para purificar los productos amplificados. Prepare un gel de AGAROSA al 1,8 % de 50 mililitros utilizando agua grado HPLC, añada TAE y bromuro después de que la agarosa haya fundido. A continuación, vierta el gel y cargue el gel.

Después de agregar cuatro microlitros de tampón de carga a las muestras de entrada y de inmunoprecipitación, ejecute el gel a 120 voltios durante 45 minutos. Analice el gel después de su electroforesis. Esto debería revelar que se producen fragmentos en el rango entre 150 y 350 pares de bases.

Representan fragmentos de ADN genómico de entre 50 y 250 pares de bases de longitud. Y con un escalpelo, excíndase la región del gel que contiene el material en el rango de 150 a 350 pares de bases. Téngase cuidado en evitar excindir la banda del adaptador, que migra a aproximadamente 120 pares de bases.

Recupere el ADN utilizando un kit rápido de extracción de geles kayak siguiendo las instrucciones del fabricante. Seque la muestra hasta exactamente 11 microlitros en un concentrador de vacío sin calor. Retire un microlitro de la muestra y mida la concentración de ADN utilizando un espectrofotómetro NanoDrop.

Finalmente, identifique los productos génicos enriquecidos utilizando el analizador genómico Illumina y analice los sitios de unión y los genes diana según se describe en el protocolo escrito. Las coordenadas genómicas de las regiones enriquecidas identificadas de unión a la proteína RB o unión a RBP dos se presentan en un formato organizado por cromosoma. Las ocupaciones de los genes del conjunto en los cromosomas pueden visualizarse como VAR negros.

Aquí se muestran las ocupaciones del cromosoma 10; dos regiones de unión de rbp dos se indican como líneas verticales. El panel central muestra todas las regiones de unión de los isoformos de rbp dos en el cromosoma 10, y el panel inferior muestra las regiones de unión del isoformo grande de rbp dos. Esta información proporciona una visión general de la ocupación superpuesta y específica de los isoformos de RBP dos en el cromosoma 10.

Aquí se muestra un mapa de calor con las categorías de función molecular de la ontología genética (go) significativamente enriquecidas, corregidas por la tasa de falsos descubrimientos o FDR, entre los genes unidos por rbp. Dos tonos hacia el rojo indican alta significancia estadística. El amarillo indica baja significancia estadística, y el gris indica ausencia de significancia estadística.

El análisis de enriquecimiento muestra las funciones moleculares superpuestas y específicas de isoformas de los genes diana del R BP dos. Acabamos de mostrarle cómo identificar los sitios de unión de factores de transcripción durante este procedimiento. Es importante producir fragmentos de ADN dentro del rango de tamaño y rendimiento adecuados.

Esto puede lograrse siguiendo nuestras pautas durante el paso de SONECACIÓN. Eso es todo. Buena suerte con sus experimentos y gracias por vernos.