Grabaciones de patch clamp de neuronas de ratón de retina en una rebanada preparación adaptada a la oscuridad

Nuestra experiencia visual comienza cuando el pigmento visual en los fotorreceptores de la retina absorbe fotones de energía luminosa, lo que finalmente conduce al cierre de los canales activados por nucleótidos cíclicos en la membrana celular. Esto suprime la liberación del neurotransmisor glutamato tanto en bastones como en conos. El glutamato liberado es detectado por células retinianas descendentes para estudiar las señales posteriores.

Los ojos se extraen de un ratón sacrificado. Los S se aíslan, se incluyen en un bloque de agar y se cortan utilizando un microtomo vibrante. A continuación, los cortes retinianos se colocan bajo un microscopio y se estimulan con iluminación LED.

Mientras se realizan grabaciones mediante el método de "patch clamp" para medir las corrientes o potenciales sinápticos generados, generalmente las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades debido a las complejidades adicionales de trabajar en la oscuridad. Por lo tanto, poder visualizar todo el proceso proporcionará una sensación que de otro modo sería difícil de describir.

Comience este procedimiento recubriendo los electrodos de alambre de grabación y de referencia que se utilizarán con una capa de cloruro de plata. Sumerja los electrodos en cloruro de sodio uno molar. Luego, utilizando una fuente de alimentación de 15 voltios con una onda senoidal de un hercio, aplique 15 voltios entre ellos durante aproximadamente 20 segundos.

Utilizando un tirador de micropipetas, prepare pipetas para registro del tipo patch a partir de vidrio de sílice BO pulido con llama, eligiendo una resistencia de punta de pipeta según el tamaño de las células objetivo, para cuerpos celulares de aproximadamente 20 micrones de diámetro. Utilice una pipeta con una resistencia de punta de cinco a 10 megaohmios para cuerpos celulares. Para células de alrededor de cinco micrones de diámetro, utilice una resistencia de punta de 12 a 15 megaohmios.

Para preparar los electrodos de referencia de tierra, use una jeringa para llenar un tubo de polietileno con una solución de agar al 3,5 % preparada en cloruro de sodio de un milimolar. A continuación, prepare las siguientes soluciones según las instrucciones del protocolo escrito adjunto: solución externa de baño, solución de corte, solución interna de pipeta de aspartato de potasio y el tope de agar.

Guarde todas las soluciones a cuatro grados Celsius hasta que sean necesarias. El día del experimento, retire alrededor de 1,5 mililitros de solución interna de aspartato de potasio. Luego agregue Fluor diluido.

Vierta aproximadamente 50 mililitros de medio aims que contenga bicarbonato de sodio en un recipiente de almacenamiento opaco a la luz. Conecte el tubo de plástico a un tanque de gas que contenga 5% de dióxido de carbono y 95% de oxígeno para equilibrar el medio aims con el gas, y luego coloque el recipiente en un baño de agua a 30-32 grados Celsius. A continuación, llene un frasco con 110 mililitros de medio aims que contenga he peas y colóquelo en hielo.

Igualar el medio burbujeando la solución con gas oxígeno al 100 %. Coloque el medio aimes restante que contiene bicarbonato de sodio en un depósito calentado encima de la jaula de Faraday. Envuelva con parafina el tubo y la tapa del frasco para atrapar el gas en el espacio por encima de la solución y equilibrar con una mezcla de 5 % de dióxido de carbono y 95 % de oxígeno.

Utilizando un tubo de dispersión de aire de vidrio, prepare agar al 3 % de baja temperatura de gelificación añadiendo 0,75 gramos a 25 mililitros de medio AIM con calor intenso. La solución alcanza aproximadamente 115 grados Celsius mientras se agita. Cuando la solución esté clara y sin burbujas, coloque la solución de agar fundida en un baño de agua a 42 grados Celsius.

Configure la cámara de registro sobre el microscopio invertido. Deslice un puente de agar de cinco centímetros sobre el electrodo de referencia de plata y cloruro de plata y colóquelo en la cámara de registro. La resistencia de la punta de la pipeta se puede medir llenando una pipeta con solución interna, colocándola en el porta-pipetas, introduciendo el porta-pipetas en la etapa de cabezal del amplificador y bajando la pipeta hasta sumergirla en la solución; para preservar el pigmento visual durante las grabaciones fisiológicas, todos los procedimientos deben realizarse bajo luz infrarroja utilizando gafas de infrarrojos, aunque aquí todos los procedimientos se mostrarán bajo luz ambiente.

Después de que el ratón haya sido sacrificado, use tijeras curvas para extraer rápidamente los ojos. Coloque los ojos sobre un trozo de papel de filtro para evitar que rueden. Luego sostenga un ojo en su lugar con pinzas y use una hoja delgada de doble filo para hacer una incisión en la córnea.

En cuanto se perfore el globo ocular, transfiera el ojo a una placa de Petri de 60 milímetros llena con medio aims. Utilizando la hendidura en la córnea como punto de entrada, use tijeras pequeñas para cortar las porciones restantes de la córnea.

Luego retire la lente y el humor vítreo, asegurándose de que la retina permanezca adherida a la copa del ojo. Colóquela en un recipiente opaco a la luz lleno con medio AMS equilibrado con 5% dióxido de carbono en 95% oxígeno a 32 grados Celsius.

Corte hemis sec. de una de las copas oculares utilizando una hoja de bisturí número 10. Separe la retina del epitelio pigmentario de la retina.

Retire los bordes de la retina para permitir que el tejido quede plano. Utilice una pipeta de vidrio pequeña para pasta con una perilla de látex para llenar una placa de Petri de 35 milímetros con agar fundido de baja temperatura de gelificación y arrastre la pinza a través del agar para probar su consistencia. Una vez que el agar comience a solidificarse, transfiera la retina a la superficie del agar.

Luego, sin tocar la retina, use un trozo enrollado de toalla de papel Kim para absorber la solución excedente alrededor de ella. Coloque dos o tres gotas adicionales de agar directamente sobre la retina y coloque rápidamente un cilindro de plástico para formar una pared alrededor de esta, manteniendo la retina cerca del centro del cilindro; agregue gotas adicionales de agar fundido, transfiera la placa de Petri a un baño de hielo y agua para enfriar. Después de 30 segundos, retire el tejido y use un émbolo para expulsar el bloque de agar, empujando desde el lado más alejado de la retina.

Utilice una cuchilla de un solo filo para cortar un pequeño bloque de agar que contenga la retina y pegue el bloque en su lugar contra el tope de agar en el disco de la muestra con pegamento instantáneo. Transfiera el disco de la muestra al portaobjetos del microtomo vibrante y vierta abundante medio AIM frío en el portaobjetos, dejando que el bloque con la retina quede completamente sumergido. Corte secciones retinianas con un grosor de aproximadamente 200 micrones utilizando la velocidad máxima de vibración de la cuchilla y una velocidad de avance ajustada de modo que tarde entre cuatro y cinco segundos en atravesar la retina completamente.

Utilice una hoja de bisturí número 11 para cortar cada sección utilizable del bloque, una a la vez. Coloque las secciones que contengan la retina en cámaras de registro y fíjelas. Utilizando los anclajes de secciones, los hilos de nailon cruzan el anclaje de la sección.

Sujete firmemente el agar alrededor de la retina, dejando la retina sin obstrucciones. Para las grabaciones, transfiera la cámara de grabación a la platina del microscopio vertical.

Cierre la cortina y encienda la fuente de luz infrarroja para visualizar el corte en una cámara sensible al infrarrojo. Bajo el microscopio, identifique un corte retiniano con fotorreceptores intactos en el ángulo de corte adecuado. Puede observarse algún daño superficial debido al proceso de corte.

Utilizando una pipeta con la punta rota, aspire suavemente los cuerpos celulares muertos. Para eliminar esta capa delgada de células, una vez que se haya expuesto una capa saludable de células vivas, identifique un cuerpo celular cuya posición se encuentre en las estratos de interés. Desplace la punta de la pipeta de manera que hunda ligeramente la membrana celular y aplique una presión negativa o interna suave para formar un sello de alta resistencia. El modo de célula completa se puede lograr aplicando presión negativa al electrodo para penetrar en la célula.

A continuación, estimule el tejido retiniano con luz utilizando LED para evocar respuestas. Al final de la grabación, capture una imagen usando la luz de excitación adecuada para el fluoróforo que se dializó dentro de la célula desde la solución interna de la pipeta. Aquí se muestran los potenciales evocados por la luz de una neurona retiniana adaptada a la oscuridad frente a destellos de luz de intensidad creciente.

Esta figura es una imagen de fluorescencia tomada de un corte retiniano en el que las células se han llenado con el fluoróforo Lucifer amarillo; la fluorescencia inducida muestra la morfología de las células de las cuales se realizaron grabaciones mediante parche. Después de ver este video, debería tener una mejor comprensión de algunas de las complejidades de realizar grabaciones de parche en cortes retinianos adaptados a la oscuridad. El objetivo de este procedimiento es medir las respuestas inducidas por la luz bajo iluminación controlada.

Para hacer esto, primero debemos aislarel a retina, incrustarla en agar y luego preparar secciones retinianas a partir de las cuales podemos realizar grabaciones de una sola célula.