La visualización de larvas Nervios segmentarios en 3 ^Rd Instar Drosophila Preparación de larvas

El transporte axonal puede estudiarse mediante la visualización de los nervios segmentarios larvales. Una drosófila de tercer estadio. Primero se disecciona la larva, exponiendo el SNC sin dañar los lóbulos ópticos, el ganglio ventral ni los nervios segmentarios.

El segundo paso del procedimiento consiste en fijar la larva en formaldehído antes de incubarla con el anticuerpo primario durante la noche y con el anticuerpo secundario durante una hora en la oscuridad. Luego, la larva se monta sobre un portaobjetos y se analizan los defectos en el transporte axonal. La localización y distribución de proteínas pueden examinarse mediante microscopía de inmunofluorescencia.

Aunque este método puede proporcionar información sobre el transporte axonal, también puede aplicarse a otros sistemas, como la morfología de sinapsis y músculos. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque inicialmente es difícil realizar esta disección permisible, especialmente para mantener intactos los nervios segmentarios cerebrales y los músculos. Para comenzar este procedimiento, prepare una solución fijadora de tampón de disección al 1x, PBT al 1x y una solución de BSA al 5 %.

Como se detalló en la tabla mostrada antes de la disección, reúna un par limpio de tijeras número cinco para bíceps, un par limpio de tijeras rectas en abanico y alfileres para comenzar la disección; utilice una cucharilla micro para recolectar larvas errantes en estadio de tercer instar con un genotipo específico y colóquelas en una placa de Petri. Luego, lave las larvas enjuagándolas en una placa de Petri llena con agua desionizada para eliminar toda la comida.

A continuación, coloque una larva en el platillo del guardia S con el lado dorsal hacia arriba. Sujeccione la larva en su extremo anterior y posterior. Coloque una gota del tampón de disección de un solo uso sobre la larva sujeta utilizando tijeras finas.

Pinche la larva en la línea media dorsal cerca del extremo posterior. Con las tijeras, corte la cutícula de la larva desde el extremo posterior hasta el extremo anterior. Coloque una gota de nuevo tampón de disección al uno por ciento sobre la larva diseccionada.

Con un alfiler, tome un borde lateral de la cutícula cerca del centro de la larva y sujete la cutícula utilizando otro alfiler. Para el segundo borde lateral de la cutícula, se utilizan dos alfileres en cada lado lateral, como se muestra en el diagrama. Ahora, retire cuidadosamente el intestino, los cuerpos grasos y el cordón nervioso, dejando únicamente el cerebro con los dos lóbulos ópticos y los ganglios ventrales.

Con los nervios segmentarios fijados, se realiza a continuación la fijación y la tinción con anticuerpos manteniendo las larvas adheridas al platillo de protección. Incube las larvas diseccionadas en 50 microlitros de fijador durante 30 minutos. Después de la fijación, reemplace el fijador cada 15 minutos y lave las larvas en PBT 1X durante 30 minutos.

Al reemplazar el tampón cada 10 minutos, es importante tener en cuenta que las larvas siempre deben estar sumergidas en tampón. Prepare la solución de anticuerpo primario diluyéndolo a la concentración adecuada en la solución de BSA al 5%. Las concentraciones óptimas varían según el anticuerpo.

Construya una cámara húmeda forrando un recipiente de plástico con Kim. Wipe empapado en agua. Reemplace la última vez PBT.

Lave con la solución de anticuerpo primario preparada e incube en la cámara húmeda a cuatro grados Celsius durante la noche del día siguiente. Lave las larvas diseccionadas en PBT 1x durante 30 minutos, reemplazando el tampón cada 10 minutos. Prepare el anticuerpo secundario diluyéndolo a la concentración adecuada en la solución de BSA al 5 %.

Y envuelva la cámara húmeda con papel de aluminio, ya que algunos anticuerpos secundarios son sensibles a la luz. Incube las larvas con la solución de anticuerpo secundario a 25 grados Celsius durante una hora. Una vez finalizada la incubación con el anticuerpo secundario, enjuague las larvas en PBT 1X durante 30 minutos, reemplazando el tampón cada 10 minutos, y proceda a montar y visualizar las larvas disecadas antes de montar la larva en el portaobjetos.

Prepare el portaobjetos extendiendo dos líneas verticales de esmalte de uñas en el centro, dejando un espacio suficientemente grande para que una laminilla pueda reposar encima, como se muestra en el diagrama. Deje que el esmalte de uñas se seque completamente. Coloque una gota de medio de montaje en el espacio entre las líneas verticales de esmalte de uñas sobre el portaobjetos, como se muestra en esta imagen.

El portaobjetos ya está listo para su montaje. Recupere las larvas después del último lavado con PBT. Enjuague y retire suavemente las agujas laterales de una larva.

Tenga cuidado de no romper la cutícula con cuidado. Retire los dos alfileres restantes y tome la larva con pinzas, colocándola sobre la laminilla preparada. Asegúrese de que la larva no esté volteada y esté orientada de forma ventral.

Coloque suavemente un cubreobjetos en posición vertical y selle los bordes con esmalte de uñas como se ilustra aquí. Las larvas ya están listas para su visualización bajo un microscopio fluorescente. Esta imagen representativa corresponde a una larva de tipo silvestre teñida con anticuerpos contra la proteína de la vesícula sináptica, proteína de cadena de cistina.

Los nervios segmentarios de lava están teñidos de manera uniforme aquí. Un mutante de proteína motora lava fue teñido con anticuerpos contra CSP. Los nervios segmentarios muestran acumulaciones masivas que se tiñen intensamente para CSP.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar conservar los nervios segmentarios unidos al cerebro y mantener los músculos intactos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar la disección. Fije una inmunotinción en tercer lugar e inicie los nervios segmentarios larvales para estudiar el transporte axonal utilizando un microscopio fluorescente.