Transfección de células individuales en embriones de pollo

El objetivo general de este procedimiento es inyectar células individuales de somitas o tubos neurales con un plásmido que codifica la proteína verde fluorescente. Esto se logra primero estirando pipetas de microinyección con un diámetro adecuado de abertura en la punta. El segundo paso del procedimiento consiste en preparar un stock de plásmido para las inyecciones.

El tercer paso del procedimiento consiste en preparar los embriones para la inyección. El cuarto paso del procedimiento consiste en cargar las micropipetas con ADN plasmídico. El paso final del procedimiento consiste en inyectar los tejidos deseados.

Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran el rango de derivados en cuanto al número de células producidas por progenitores individuales marcados en subdominios seleccionados del somito y del tubo neural mediante microscopía de inmunofluorescencia. Hola, soy Rael del Laboratorio de la Profesora Heim en el Departamento de Neurobiología Médica de la Universidad Hebrea de Jerusalén. Hoy les mostraremos un procedimiento para inyectar células individuales de los somitos y tubos neurales de pollo.

Utilizamos este procedimiento en el laboratorio para estudiar la segregación de líneas de células somáticas y del tubo neural. Así que comencemos. Para generar células transfectadas individuales en embriones de pollo, empiece por elaborar micropipetas. Tiramos de nuestras pipetas en un micropipeteador estándar Naga PP 83 con un ajuste de calor de 13,5.

El ajuste preciso debe calibrarse para lograr un diámetro de punta de pipeta entre ocho y diez micrones. Utilizamos filamentos que contienen tubos de vidrio de silicato de boro con un diámetro externo de un milímetro y un diámetro interno de 0,75 a 0,78 milímetros. También puede utilizarse micropipetas comerciales disponibles, sin filamento, con un diámetro externo de un milímetro y un diámetro interno de 0,75 milímetros.

Las pipetas preparadas se almacenan en un recipiente de plástico con las puntas protegidas del contacto con el borde del recipiente. Para preparar el ADN para la microinyección, el plásmido de interés se transfecta en *E. coli* DH5α. Al día siguiente, utilizando procedimientos estándar, el plásmido se purifica mediante un kit Maxi prep; para inyecciones no clonales, utilizamos una concentración de ADN de un microgramo por microlitro.

Para experimentos en los que se deseen clones individuales, la concentración del plásmido será mucho más baja y necesitará ajustarse. Para P-C-A-G-G-F-P-A, una concentración de 0,05 a 0,1 microgramos por microlitro funciona bien. Una vez determinada la concentración óptima, recomendamos diluir todo el stock de plásmido purificado, en lugar de preparaciones individuales, hasta una concentración predeterminada.

Este último podría introducir cierta variabilidad en las tasas de éxito, probablemente debido a variaciones en la pureza y otros parámetros, como la proporción de plásmido en forma de superenrollamiento. Para preparar los huevos para la microinyección, los huevos de pollo incubados mientras estaban colocados sobre su eje longitudinal hasta el estadio de desarrollo deseado se limpian con etanol al 70 % y se dejan secar. A continuación, se perfora el extremo puntiagudo del huevo con tijeras quirúrgicas. Utilizando una jeringa de 10 mililitros y una aguja de calibre 19, se extraen dos mililitros de albúmina del huevo, y luego se sellan los orificios con parafina caliente antes de la inyección.

Utilice tijeras quirúrgicas para abrir una ventana en la parte superior del cascarón del huevo con el fin de evitar que los desechos entren por el orificio. Coloque un trozo de cinta adhesiva sobre la ventana y corte un agujero a través de ella. Para ayudar a visualizar el embrión, use una micropipeta estirada con fuego montada en un aspirador para inyectar una tinta no tóxica, como la tinta Pelican 17, debajo del blastodermo.

A continuación, acceda al embrión cortando y desviando las membranas vitelina y/o amniótica utilizando alfileres de insecto de 0,14 milímetros montados en un portagujas para cargar el ADN en la pipeta capilar Eloqua y agregue una pequeña cantidad de polvo verde rápido mediante la capilaridad. Aspire una cantidad mínima de plásmido mediante una capilar de diámetro adecuado conectada a un aspirador. Luego, insértela en el extremo de la pipeta opuesto a la punta afilada y cargue el ADN lo más cerca posible del extremo afilado.

A continuación, sujete la pipeta a un inyector manual de presión de aire montado en un micromanipulador. Aplique una cantidad mínima de presión si es necesario para permitir que la solución del plásmido alcance la punta de la pipeta. Introduzca la pipeta en el medio líquido del huevo mientras aplica algo de presión de aire para evitar que se obstruya la punta de la pipeta.

Una vez que se atraviesa el dominio tisular relevante, el cambio de presión suele ser suficiente para liberar el plásmido junto con el verde rápido visible. Si esto no ocurre, aplique una ligera presión sobre la jeringa hasta que se expulse la mezcla de plásmido y verde rápido. Repita este procedimiento a lo largo del eje del embrión; puede añadirse PBS tras la inyección.

Finalmente, selle la ventana con cinta adhesiva y devuelva los huevos al incubador. Evite la ventilación e incluya pequeños recipientes con agua en el incubador para ayudar a mantener la humedad y aumentar los rendimientos. Si el sitio objetivo de la inyección fue lo suficientemente superficial como para ser claramente aparente, como dentro de los somitos dorsales, el tubo neural o el ectodermo, se puede medir la tasa de éxito del experimento realizando una observación en montaje completo utilizando un binocular fluorescente.

Este paso es particularmente útil para evaluar si se han marcado demasiadas o muy pocas células. Si se desea una incubación adicional, agregue solución de PBS con antibióticos al huevo después de la observación y reemplace la cinta del techo. Además, se puede evaluar la tasa de éxito de la inyección mediante la sección seriada de los embriones y la realización de inmunohistoquímica.

Después de cuatro horas o más, los embriones se fijan y se procesan para su inclusión en parafina. Luego, los cortes montados sobre portaobjetos de vidrio se desparafinan y se inmunotincionan; para la amplificación de la visualización del reportero, podrían ser deseables métodos como la biotina-estreptavidina. Finalmente, se escanean los cortes seriados para detectar células marcadas en los segmentos inyectados.

Si en los ensayos iniciales se obtienen múltiples células en lugar de células individuales, el stock de plásmido debe diluirse y el procedimiento debe repetirse hasta lograr resultados adecuados. Normalmente realizamos una única inyección de P-C-A-G-G-F-P por ácaro, dirigiéndonos a entre seis y doce segmentos por embrión. En estas condiciones, puede detectarse una señal clara mediante observación en preparación completa, ocho horas después de la inyección, en al menos un segmento de un embrión de cada diez.

En este ejemplo, se inyectó un plásmido que codifica para GFP en un mite, y cinco horas después se observó una sola célula fluorescente en una vista de montaje completo del embrión mostrado aquí. Cuando se observó 24 horas después de la inyección en el mite central, se detectó un clon de células fluorescentes en un embrión montado integralmente dos días después de la inyección clonal. El corte de este segmento revela la presencia de progenie clonal en la dermis y en el músculo, demostrando que un único progenitor genera ambos derivados.

En cuanto a los somitos, también se pueden empalar progenitores neuroepiteliales individuales en el tubo neural dorsal, como se ilustra en esta sección transversal, fotografiada cinco horas después de la inyección aquí. El análisis de secciones seriadas reveló que se lograron transfecciones clonales cuando la tasa de éxito era de aproximadamente el 10%. Esto significa que, para alcanzar la clonalidad, la técnica es por definición altamente ineficiente. Por otro lado, bajo estas condiciones, más del 93 % de los eventos de marcado positivo resultaron ser clonales.

Acabamos de mostrarle cómo inyectar células individuales de embriones de pollo al realizar este procedimiento. Es importante recordar diluir una gran cantidad de plásmido stock hasta una concentración ideal para infecciones en células individuales, y luego utilizarla durante todos sus experimentos. Eso es todo.

Gracias por ver el video y buena suerte con sus experimentos.