Expresión, la solubilización de detergente, y purificación de un transportador de membrana, la proteína de resistencia a múltiples fármacos MexB

Con el fin de purificar la proteína de membrana Mex B, primero se expresa Mex B en e coli mediante métodos de ADN recombinante. Luego se aíslan las membranas y las proteínas de membrana se solubilizan con un detergente suave. La proteína de membrana solubilizada se purifica mediante iMac y la proteína se purifica adicionalmente mediante cromatografía de filtración en gel.

El grado de purificación de la proteína se determina mediante electroforesis en gel de poliacrilamido SDS. Aunque este procedimiento puede proporcionar información sobre transportadores transmembrana de resistencia múltiple a fármacos, también puede aplicarse a otras proteínas de membrana. Los procedimientos que se demostrarán hoy serán realizados por un estudiante de posgrado de mi laboratorio. Para este procedimiento, Mex B de Pseudomonas aeruginosa será subclonado en el vector de expresión pET-30b(+) de manera que Mex B se exprese con una etiqueta de hexahistidina en el extremo C. Comience por la tarde inoculando cuatro cultivos de tres mililitros de LB con canamicina utilizando transformantes frescos o una muestra congelada, y cultive los medios en un agitador rotatorio a 37 grados Celsius durante toda la noche. Por la mañana.

Utilice los cultivos de la noche anterior para inocular 150 mililitros de LB que contienen 30 microgramos por mililitro. ¿Puede Mycin hacer crecer el cultivo a 37 grados Celsius en un agitador durante la tarde? Utilice el cultivo pequeño para inocular seis veces un litro, dos medios XYT que contienen 30 microgramos por mililitro.

¿Puede la micina en frascos Erlenmeyer? Utilice 25 mililitros por cultivo para una dilución de uno a 40. Incube los cultivos a 37 grados Celsius hasta que alcancen una densidad óptica.

600 de 0,4 a 0,6, aproximadamente 1,5 horas. Cuando los cultivos alcancen la densidad adecuada, induzca la expresión proteica añadiendo 0,5 mililitros de IPTG un molar. Devuelva todos los matraces al agitador y continúe el crecimiento a 30 grados Celsius durante la noche hasta cosechar las bacterias a la mañana siguiente.

Saque los cultivos del agitador y enfríelos. Luego, para recolectar las células, transfiera los cultivos a tubos de centrífuga y centrifugue a cuatro grados Celsius durante 30 minutos a 5.000 rotaciones por minuto en una centrífuga de gran escala mientras las células están centrifugándose. Suplemente 100 mililitros de tampón de re-suspensión celular con inhibidores de DNAsa y lisozima.

Además, suplemente dos alícuotas del tampón de suspensión de membranas Resus con inhibidores de proteasas como se muestra en esta tabla. Mantenga las tres soluciones en hielo una vez finalizada la centrifugación. Resuspenda los pellet celulares en 100 mililitros de tampón de suspensión celular Resus.

A continuación, extraiga las células. La suspensión celular se carga en la celda de presión francesa y la celda se coloca en la prensa francesa. Se aplica presión hasta que alcance 12.000 libras por pulgada cuadrada.

Se abre la válvula una cantidad muy pequeña para que las células rotas salgan gota a gota. Es importante no abrir demasiado la válvula y permitir que las células salgan en chorro, ya que se liberarán con poca presión y no se romperán de manera eficiente. Recolecte el lisado celular en un frasco, manteniéndolo frío sobre hielo.

Pase la solución celular nuevamente a través de una celda de presión francesa a 12.000 libras por pulgada cuadrada. Transfiera el lisado celular a tubos de centrífuga SS 34 y centrifugue para eliminar los restos celulares a 10.000 rotaciones por minuto durante 30 minutos a cuatro grados Celsius en un rotor SS 34. A continuación, se obtiene el lisado clarificado.

Utilizado para preparar la fracción de membrana. Transfiera cuidadosamente el sobrenadante a tubos de ultracentrífuga ti. 6 4, 7 0.5, y centrifugue en un rotor TI 6 4 7 0.5 a 40,000 rotaciones por minuto durante 50 minutos a cuatro grados Celsius.

Deseche el sobrenadante. Utilice una pipeta para resuspender suavemente el precipitado, que contiene las membranas celulares, en aproximadamente 25 mililitros de tampón de resuspensión de membranas. Transfiera la suspensión de membranas a un tubo de centrífuga limpio y centrifugue en un rotor TI I 6 4 7 0.5 a 40.000 rotaciones por minuto durante 50 minutos a cuatro grados Celsius, y resuspenda la pastilla de membranas lavadas en 25 mililitros de tampón de resuspensión de membranas. A continuación, solubilice las proteínas de membrana en las membranas resuspendidas en aproximadamente 25 mililitros.

Añada seis mililitros de DDM al 10 % para que la concentración final de detergente sea del 2 % DDM, y agite la mezcla a cuatro grados Celsius durante dos horas. Después de la incubación de dos horas en presencia de DDM, centrifugue la mezcla a 40.000 rotaciones por minuto durante 40 minutos a cuatro grados Celsius en el rotor TI I 6 4 7 0.5, con el fin de separar los complejos proteína-detergente solubles de las proteínas insolubles. Guarde el sobrenadante que contiene los complejos proteína-detergente de Mex B para usarlos en la purificación. Mezcle el sobrenadante que contiene los complejos proteína-detergente de Mex B con dos mililitros de perlas de afinidad por metales pesados equilibradas en tampón de suspensión Resus, e incube durante una hora en un agitador rotatorio a cuatro grados Celsius, tras la unión de las proteínas a la resina.

Vierta la suspensión en el cuerpo de una columna de flujo por gravedad y deseche el flujo inicial. Lave la columna con 20 mililitros o 10 volúmenes de columna del tampón de unión y lavado iMac cuando finalice el lavado de la columna. Eluya las proteínas retenidas con 10 mililitros del tampón de elución iMac.

Tome muestras de 10 microlitros de cada fracción de elución. Mézclelas con 10 microlitros de tampón de muestra SDS al doble de concentración y analícelas en un gel de poliacrilamida al 10 % SDS.

Estime la cantidad y pureza de mex B en cada fracción. Recupere las fracciones que contienen los complejos detergentes de la proteína Mex B y concéntrelas en un concentrador centrífugo a cuatro grados Celsius. Tenga cuidado de que la proteína no precipite en este paso.

Realice varios centrifugados breves y observe la precipitación. Después de cada centrifugado, continúe purificando las fracciones agrupadas mediante una columna de filtración en gel. Equilibre previamente una columna Super Rose 12 HL 30/10 con 24 mililitros de tampón de corrida y espere hasta obtener una línea base plana.

A continuación, enjuague el bucle de carga del sistema de columnas con tampón de corrida. Antes de aplicar la proteína a la columna, filtre la solución de proteína utilizando un filtro de jeringa. Luego, cargue hasta 240 microlitros de la solución de proteína en la columna, con una proteína de hasta cinco miligramos por mililitro.

Corra 1,5 volúmenes de columna de tampón y recoja fracciones de 0,25 mililitros. Los complejos de proteína XB con detergentes eluyen como un pico alrededor de 10 a 15 mililitros de volumen de elución. Tome muestras de cinco microlitros de las fracciones del pico.

Mezcle cada muestra alícuota a alícuota con tampón de muestra SDS al doble de concentración. Analice las muestras en un gel de poliacrilamida al 10 % para estimar la cantidad y pureza de me Mex B en cada fracción; recoja las fracciones que contengan ME B puro. Este gel de poliacrilamida se cargó con fracciones recolectadas de la columna iMac y fracciones individuales de la columna de filtración en gel. Después de la columna de filtración en gel, la proteína aparece pura en el gel de poliacrilamida teñido con kumasi.

Un trazado de la columna de filtración en gel muestra el pico principal del complejo proteína-detergente eluyendo de la columna. El rendimiento promedio de la proteína mxb es aproximadamente de dos miligramos por seis litros de cultivo 2XYT. Una vez dominado, este procedimiento puede realizarse en ocho horas si se lleva a cabo correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo expresar, solubilizar y purificar una proteína de membrana.