Visualización de la replicación del ADN mitocondrial en las células individuales de amplificación de la señal Edu

El objetivo general de este procedimiento es marcar y visualizar la replicación del ADN mitocondrial en neuronas cultivadas. Esto se logra primero incubando las neuronas con el análogo de timidina EDU durante dos a 24 horas. El segundo paso del procedimiento consiste en marcar el EDU que contiene un alquino con el azida verde fluorescente orgon 488 mediante una reacción covalente catalizada por cobre.

El paso final del procedimiento consiste en amplificar la señal de orgon verde mediante un paso de amplificación de señal con aramida para visualizar el EDU que se incorporó en el ADN mitocondrial recién sintetizado. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran la replicación del ADN mitocondrial en compartimentos subcelulares específicos de las neuronas, mediante la combinación de la química de click del EDU y la posterior amplificación de señal por técnica de amplificación de señal. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la marcación con BRDU es que la marcación con EDU es más sencilla y más suave, lo que permite realizar tinciones inmunofluorescentes adicionales de marcadores neuronales.

Este método puede responder preguntas clave en la regulación del número de mitocondrias, como cómo las neuronas satisfacen las demandas energéticas cambiantes en sus compartimentos subcelulares, incluyendo cuerpos celulares, axones, dendritas y terminales sinápticos. Por lo tanto, este método puede proporcionar información sobre los mecanismos subyacentes a la patogénesis de múltiples enfermedades neurológicas basadas en mitocondrias, incluyendo neuropatías y neurodegeneración. Pero, de manera importante, también puede aplicarse a otros sistemas en los que los cambios en el número de copias del ADN mitocondrial probablemente subyagan a la patogénesis del estado patológico, incluyendo la toxicidad por fármacos, el cáncer y el envejecimiento.

Este video demostrará cómo marcar el ADN mitocondrial recién sintetizado, abreviado como M-T-D-N-A, en neuronas de ganglios de la raíz dorsal cultivadas sobre cubreobjetos estériles de 12 milímetros. En una placa de cultivo de 24 pocillos, diluya el stock de 10 milimolar de cinco etinil-2'-desoxiuridina, abreviado como EDU del kit de ensayo Clicka EDO Microplate, uno a 100 en medio de cultivo para obtener un stock de 10 XEDU. Luego se agrega directamente el stock de 10 XEDU al medio en cada pocillo. Incube las neuronas tratadas durante dos a 24 horas a 37 grados Celsius y 5 % de dióxido de carbono en una campana extractora.

Fije las neuronas en paraformaldehído al 2% durante 10 a 15 minutos a temperatura ambiente. Lave dos veces en PBS 1X durante dos a cinco minutos por cada lavado. Las neuronas fijadas pueden almacenarse en PBS 1X fresco a cuatro grados Celsius durante hasta un mes.

Prepare una cámara húmeda según se describe en el texto adjunto. Utilice pinzas de punta fina para transferir 28 cubreobjetos fijados, incluyendo controles positivos y negativos de EDU, a láminas de paraform hidrofóbico dentro de la cámara húmeda. Aplique nuevamente entre 200 y 300 microlitros de un XPBS para cubrir la superficie de cada cubreobjeto.

Prepare el kit de ensayo Click it según se describe en el texto y siga las instrucciones del fabricante para marcar el ADN mitocondrial con 75 a 80 microlitros de una solución permeabilizante que contiene 0,1 % de Triton X en 1X PBS sobre cada cubreobjetos, incube a temperatura ambiente durante 10 minutos. Utilice una pipeta de bulbos con una punta de 200 microlitros acoplada al extremo para retirar suavemente el líquido sin perder las células.

Utilice una pipeta con pera para inundar suavemente la cubeta. Enjuague con 200 a 300 microlitros de un XPBS para eliminar completamente la solución anterior. Enjuague cada cubeta dos veces.

Pipetee de 75 a 80 microlitros de peróxido de hidrógeno fresco al 1 % en un XPBS sobre cada cubreobjetos. Incube cubierto durante 30 minutos a temperatura ambiente para inhibir la actividad de peroxidasa endógena. Enjuague dos veces con un XPBS como antes, y prepare frescamente el cóctel de reacción de click según se detalla en el texto adjunto.

Aspire arriba y abajo para mezclar. No vortexar; fije los neuronas con 75 a 80 microlitros de fijador click en EDU por cubreobjetos e incube a temperatura ambiente durante cinco minutos. Durante la incubación de fijación posterior, diluya el cóctel de reacción con un volumen igual de fijador clicka EDU.

Añada el cóctel de reacción a cada cubreobjetos para protegerlo de la luz e incube a temperatura ambiente durante 25 minutos. Retire suavemente el cóctel de reacción y lave dos veces con tampón de bloqueo diluido al uno x bajo un microscopio epifluorescente. Verifique la tinción verde orgánica en los núcleos cuando la tinción de EDU esté completa.

Comience la amplificación de señal con termitas o TSA agregando solución bloqueadora de TSA al 1 % a cada cubreobjetos e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Gire brevemente por centrifugación el anticuerpo stock conjugado con peroxidasa de rábano picante verde, preparado entre dos y 24 horas antes de la dilución en TSA. Diluya el anticuerpo primario uno a 300 en la solución bloqueadora de TSA e invierta o pase por pipeta para mezclar; agite suavemente en vórtex. Añada 75 microlitros a cada cubreobjetos e incube a cuatro grados Celsius durante la noche.

Al día siguiente, lavar tres veces con un XPBS a temperatura ambiente. Incubar las laminillas en el lavado final durante 30 a 60 minutos adicionales para asegurar la eliminación del anticuerpo primario no unido. Preparar la reacción IDE de acuerdo con la sección de texto de este protocolo inmediatamente antes de su uso.

Incubar los cubreobjetos con la reacción IDE durante 15 minutos a temperatura ambiente. Lavar tres veces con un XPBS, incubando en el último lavado de 30 a 60 minutos como antes bajo el microscopio. Verificar la etiqueta de ADN mitocondrial y montar neuronas teñidas con éxito sobre portaobjetos de vidrio con un medio de montaje ANTIFA que contiene DPI; las imágenes mostradas aquí son representativas de imágenes de contraste de interferencia diferencial de neuronas del ganglio de la raíz dorsal embrionarias y adultas que se utilizan típicamente para el análisis.

Estos diagramas esquemáticos representan el procedimiento para etiquetar EDU en el ADN mitocondrial con una señal fluorescente verde. Las células de neuroblastoma F11 con actividad mitótica sirven como control positivo y muestran el patrón de etiquetado de EDU incorporado en el ADN nuclear y mitocondrial en estas imágenes representativas de fluorescencia superpuestas a campo claro. Las señales verdes punteadas muestran la señal amplificada de EDU incorporada en el ADN mitocondrial recién sintetizado de neuronas del ganglio raquídeo dorsal embrionarias y adultas.

El procedimiento de etiquetado con EDU permite la posterior tinción inmunofluorescente de marcadores neuronales como neurofilamento en rojo. Estos diagramas esquemáticos representan el procedimiento para etiquetar EDU y MTD NA con una señal fluorescente roja. Las células de neuroblastoma F11 con actividad mitótica sirven como control positivo e ilustran el patrón de etiquetado de EDU incorporado en el ADN nuclear y mitocondrial.

Este diagrama esquemático representa el procedimiento para marcar BRDU en M-T-D-N-A recién sintetizado con una señal fluorescente verde o roja. Al realizar este procedimiento, es importante recordar incluir controles utilizando células mitóticamente activas para verificar el etiquetado exitoso de EDU y los núcleos celulares antes de pasar a los pasos de amplificación para visualizar el marcado de ADN mitocondrial siguiendo este procedimiento. Se pueden realizar otros métodos, como la inmunofluorescencia estándar, para responder preguntas adicionales, como cómo se regula la síntesis del ADN mitocondrial en subpoblaciones específicas de neuronas o compartimentos neuronales. Debido a su desarrollo, esta técnica allanará el camino para que los investigadores en el campo de la neurobiología exploren la regulación del número de mitocondrias en modelos celulares tanto de fisiología normal como de modelos celulares que simulan enfermedades alteradas.

Estados neurológicos.