Preparación de inmunógeno ratón hipófisis para la inducción de la hipofisitis autoinmune experimental

La hipofisitis autoinmune se caracteriza por un agrandamiento de la glándula pituitaria y una deficiencia en una o más hormonas hipofisarias. Los autoantígenos causantes permanecen desconocidos. Aquí se demuestra un protocolo para preparar proteínas de la glándula pituitaria de ratón para su uso en el estudio de esta enfermedad.

Primero se aíslan las glándulas pituitarias de ratones sacrificados. Luego, las pituitarias se homogenizan para romper mecánicamente las células y liberar las proteínas citosólicas. El homogenato se clarifica mediante centrifugación a baja velocidad y se evalúa su cantidad mediante un ensayo colorimétrico de BCA y su calidad mediante electroforesis en gel de poliacrilamida.

Finalmente, el homogenato acuoso de proteínas se mezcla con un adyuvante oleoso. Esta mezcla se inyecta luego en ratones para crear un modelo murino que se asemeja a la hipofisitis autoinmune. Como se muestra en el video complementario, se han descrito cuatro técnicas para inducir hipofisitis en animales experimentales.

La técnica presentada en este artículo, que consiste en la inyección de una mezcla de proteínas hipofisarias con adyuvante de gripe, es la más antigua, que data de la década de 1960. Otros enfoques han sido la inyección de glicoproteínas solubles del virus de la rubéola en 1992, la inyección estereotáxica de un adenovirus directamente en la glándula pituitaria en 2002, y el trasplante de glándula pituitaria de una cepa de rata bajo la cápsula renal de otra cepa de rata en 2010. La principal ventaja del enfoque con adyuvante de Florence es que actualmente es menos invasivo, más consistente y, sobre todo, más preciso para inducir una enfermedad que se asemeja estrechamente a la enfermedad humana.

Aunque se ha informado desde la década de 1960, la técnica del adyuvante extranjero tuvo un desempeño deficiente para la inducción de hipofisitis. Cuando comencé mi trabajo de doctorado, solo podía obtener una incidencia y gravedad modestas de hipofisitis utilizando el protocolo publicado con adyuvante extranjero. Las cosas mejoraron significativamente cuando se me ocurrió la idea de aumentar diez veces la cantidad de proteínas de la hipófisis contenidas en la emulsión EM.

Aunque este método puede proporcionar información sobre la patogénesis de la hipofisitis autoinmune, también puede utilizarse para estudiar otras enfermedades autoinmunes cuyos autoantígenos aún no se han identificado. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades principalmente con el último paso, la preparación del margen, ya que requiere habilidades manuales, tiempo y dedicación. Por ello, la demostración visual es fundamental para comprender cómo debe prepararse una emulsión adecuada.

La implicación de esta técnica va más allá del campo de la autoinmunidad. Saber cómo preparar el antígeno inmunizante también puede utilizarse en la producción de anticuerpos monoclonales o para probar nuevas vacunas. Esta técnica será demostrada por S Zoo Heroic Ura y Mayland al Gato de mi laboratorio.

La glándula pituitaria del ratón es una glándula con forma cilíndrica que se sitúa en la base del cráneo, en una depresión del hueso esfenoides denominada fosa hipofisaria. La glándula está limitada lateralmente por los nervios trigéminos y anteriormente por el quiasma óptico. Está compuesta por un lóbulo anterior más grande y por lóbulos intermedio y posterior más pequeños.

Para aislar la glándula pituitaria, use tijeras para decapitar al ratón eutanasiado, luego realice cortes paralelos desde la parte posterior hasta la frontal del cráneo. Levante el cerebro y dóblelo hacia atrás para exponer la glándula pituitaria, que aparece como un cilindro en el contexto de un triángulo isósceles. Teniendo a la glándula pituitaria como base, a los nervios trigéminos como lados y al quiasma óptico como vértice.

Rodee la glándula con las puntas de las pinzas cerradas para romper las meninges circundantes. Luego, utilizando pinzas finas, tome la hipófisis de la fosa turca y colóquela en un tubo de plástico sobre hielo seco. Para una preparación, recolecte 300 glándulas hipofisarias de ratón.

Esta colección requiere aproximadamente nueve horas-persona. Una vez completada la recolección, almacene las glándulas pituitarias a menos 80 grados Celsius hasta que sean necesarias. Coloque un tubo Falcon de 15 mililitros en un baño de hielo.

Agregue al tubo 250 microlitros de tampón de homogenización. Por cada 100 hipófisis recolectadas justo antes de la homogenización, añada las glándulas hipofisarias de ratón al tampón. A continuación, coloque la punta del homogenizador Polytron, un generador de cinco milímetros de diámetro, en el fondo del tubo Falcon que contiene las hipófisis de ratón y el tampón, y homogenice a velocidad máxima durante 30 segundos.

Mueva suavemente el tubo hacia arriba y hacia abajo mientras lo mantiene sobre hielo. Luego, deje reposar el homogenato sobre hielo durante un minuto. Repita los pasos de homogenización y enfriamiento otras dos veces.

Esta homogenización suave debe romper las células y liberar las proteínas sin romper los núcleos. Centrifugar el homogenato a baja velocidad, aproximadamente 1000 G durante 10 minutos a cuatro grados Celsius para sedimentar los núcleos, el tejido no roto y los materiales insolubles, como el tejido conectivo y los complejos de proteínas desnaturalizadas. Tener cuidado de no perturbar el precipitado.

Transfiera la SNA, ahora denominada sobrenadante postnuclear o PNS, a un nuevo tubo Falcon. Mantenga el PNS en hielo, retire el pellet utilizando el mismo volumen de tampón de homogenización que antes, homogenice y centrifugue como anteriormente. Después de reunir las dos muestras de PNS, alícuote la solución en varios tubos pequeños para microcentrífuga.

Guarde los tubos de microcentrífuga a menos 80 grados Celsius hasta que sean necesarios. Esta preparación de proteína es estable a menos 80 grados Celsius, pero pierde gradualmente su potencia. Por lo tanto, se recomienda utilizarla dentro de los seis meses posteriores a su preparación.

Guarde una pequeña alícuota del SNT para determinar el rendimiento y la concentración de proteína mediante el ensayo del ácido biy. Luego, determine la calidad de la proteína mediante electroforesis en gel a partir de 300 glándulas hipofisarias de ratón, que en promedio tienen un peso total de aproximadamente 570 miligramos. Espere un rendimiento de 60 miligramos de proteínas hipofisarias o un miligramo de proteína por cada 10 miligramos de tejido.

La concentración de proteína es típicamente de alrededor de 40 miligramos por mililitro. El ejemplo proporcionado aquí es para inmunizar 10 ratones. Planifique inyectar a cada ratón 100 microlitros de emulsión que contenga un miligramo de proteína de hipófisis, considerando dos ratones adicionales para pérdidas de material durante la preparación; aquí, se preparan 12 miligramos de emulsión de proteína.

Comience descongelando rápidamente las alícuotas de proteína congeladas calentándolas en sus manos. Ajuste la concentración de proteína a 20 miligramos por mililitro con PBS. A continuación, aspire 600 microlitros del extracto de proteína de hipófisis correspondientes a 12 miligramos en una jeringa Gas Tite Hamilton de 2,5 mililitros y resuspenda el adyuvante FRONS completo o CFA que contiene cinco miligramos por mililitro de Mycobacterium tuberculosis inactivado por calor, agitándolo manualmente.

Luego aspire 600 microlitros de la CFA hacia otra jeringa Hamilton de 2,5 mililitros. Fije y asegure una aguja emulsionadora de calibre 22 a la jeringa llena de CFA. Presione lentamente el émbolo de modo que la aguja se llene con CFA.

Luego, sujete y asegure el otro extremo de la aguja a la otra jeringa llena de extracto proteico de hipófisis. Evite atrapar burbujas de aire dentro de las jeringas. Avance lentamente el émbolo de la jeringa de CFA para introducir el componente oleoso en el extracto hipofisario acuoso, de modo que solo se mezcle una pequeña cantidad.

Luego, empuje hacia atrás el émbolo de la jeringa de extracto de hipófisis dentro de la jeringa de CFA. Repita esta acción aumentando gradualmente la cantidad de material mezclado hasta que se hayan mezclado por completo todos los contenidos. Este material blanquecino y uniformemente distribuido representa la emulsión de agua y aceite.

Una vez formada la emulsión, repita el ciclo completo de ida y vuelta al menos 500 veces. Después del ciclo final, las jeringas contendrán una emulsión de agua y aceite en relación uno a uno, en la que la concentración de proteína hipofisaria es ahora de 10 miligramos por mililitro. La emulsión está lista para usar; para probar su calidad, coloque una gota en un vaso de agua. Si la emulsión se preparó correctamente, la gota permanecerá compacta y tensa sobre la superficie.

Si la emulsión es de baja calidad, se extenderá y dividirá en gotas más pequeñas. La emulsión se inyecta el mismo día de su preparación en ratones SJL para inducir hipofisitis autoinmune experimental. Este protocolo se describe detalladamente en el joVE adjunto.

Una vez que se ha recolectado la glándula pituitaria y se dominan las técnicas, se puede realizar la instrucción proteica en una hora, recordando trabajar rápidamente y sobre hielo. Durante esta etapa, durante la preparación de la inmersión, que requiere aproximadamente una hora. Recuerde trabajar lentamente y con paciencia en la fase inicial de mezclado tras su desarrollo.

Esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la autoinmunidad exploraran los mecanismos mediante los cuales los linfocitos autorreactivos reconocen e infiltran el órgano diana. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar un extracto proteico a partir de la glándula pituitaria de ratón y cómo mezclarlo con adyuvantes de Freund completos para preparar una emulsión lista para usarse como inmunógeno. No olvide que trabajar con jeringas y adyuvantes de Freund completos, que contienen micobacterias de tuberculosis inactivadas y secas, puede ser peligroso si accidentalmente se produce una punción.

Por lo tanto, siempre use guantes desechables y deseche las agujas adecuadamente mientras realiza este procedimiento.