En la cuantificación in vivo de interacciones de proteínas G del receptor acoplado con espectralmente resuelve de dos fotones de Microscopía

El objetivo general del siguiente experimento es determinar información estequiométrica y estructural acerca de una proteína. Todos los complejos de ligamentos que expresan células biológicas vivas, las células de levadura están modificadas genéticamente para expresar las proteínas de interés unidas a una sonda fluorescente donadora o a una aceptora. Las sondas donadoras pueden excitarse directamente mediante un láser.

Aunque los aceptores solo pueden excitarse mediante una transferencia de energía desde un donador cercano previamente excitado, las células se exponen a luz de un láser pulsado de infrarrojo cercano. La fluorescencia emitida por las sondas se separa en sus componentes espectrales mediante una rejilla de transmisión y se proyecta sobre la superficie de un arreglo CCD con multiplicación de electrones. Por lo tanto, se obtienen espectros fluorescentes completos de cada ligamento individual en cada posición de la muestra.

El perfil espectral de la fluorescencia detectada depende de la interacción específica de las proteínas de interés. Los datos se analizan para determinar, para cada píxel de imagen de una célula escaneada, las emisiones separadas de las sondas donadora y aceptorora. La eficiencia de transferencia de energía se determina en cada píxel de la imagen, y luego los píxeles se agrupan según su eficiencia de FRET y su histograma.

La interpretación del histograma permite la determinación in vivo del tamaño y la configuración de proteínas y complejos. Hola, me llamo Michael Stoneman del Grupo de Investigación Riku en la Universidad de Wisconsin Milwaukee. Mi nombre es Singh.

Soy del Laboratorio Rikus en Milwaukee, Wisconsin. La principal ventaja de esta técnica es que se obtienen los perfiles completos de emisión de cientos de complejos de ligamentos dentro de una célula con un solo escaneo completo de la célula. Típicamente, la mayoría de los métodos de microscopía de fluorescencia requieren que la célula de interés sea escaneada múltiples veces para acumular suficiente información espectral y así determinar la eficiencia de FRET en diversas regiones de interés dentro de la célula.

Sin embargo, las reacciones bioquímicas por difusión pueden alterar la composición molecular de estas regiones de interés y, por ende, limitar la información obtenida en el escaneo de la imagen. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de proteínas y de la interacción entre proteínas en células vivas, como por ejemplo: ¿cuál es el tamaño de los oligómeros dañinos? ¿En qué etapa del ciclo vital de la proteína se forman los oligómeros, y cuál es el papel de los oligómeros de esta proteína en la función celular?

El microscopio de dos fotones con resolución espectral acumula información espectral sobre los complejos olímpicos en la célula de la imagen mediante el escaneo del foco del haz de excitación a través de la muestra de interés en varias ubicaciones. Se utiliza un par de espejos de escaneo ortogonales para desplazar el foco del haz láser a través de la muestra en dos direcciones diferentes. El movimiento de los espejos de escaneo está controlado por computadora y sincronizado con la extracción de datos de intensidad de fluorescencia de la cámara CCD; a partir de los escaneos en línea, pueden reconstruirse mapas espaciales de intensidad de fluorescencia correspondientes a una longitud de onda particular de luz.

Con el fin de reconstruir con precisión mapas espaciales de intensidad fluorescente de rayos X y calcular la longitud de onda real correspondiente a cada uno de estos mapas, el protocolo de escaneo lineal debe calibrarse utilizando una solución de fluoresceína. Para iniciar el procedimiento de calibración, envíe al espectro de excitación a una longitud de onda de 800 nanómetros, que es dos veces la longitud de onda máxima de excitación de la etiqueta donadora GFP dos dos para enviar al espectro de excitación, traslade el prisma ubicado dentro de la cavidad láser para modificar la dispersión de la velocidad de grupo utilizando el programa informático al que está conectada la cámara. Envíe una orden al chip CCD para reducir la temperatura del chip CCD a su temperatura más baja alcanzable.

Con el fin de reducir el ruido oscuro, pipetee 10 microlitros de solución de fluoresceína sobre un portaobjetos de microscopio y cúbralo con un cubreobjetos, de modo que una capa delgada de la muestra se distribuya uniformemente en la región entre el cubreobjetos y el portaobjetos. Coloque una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la superficie del cubreobjetos. A continuación, sujete firmemente el portaobjetos al soporte de traslación XY, Z y desplace el portaobjetos y el soporte en la dirección del eje óptico. Ajustando manualmente el actuador lineal, mueva el portaobjetos hasta que el objetivo del microscopio entre en contacto con la gota de aceite de inmersión. Cambie la cámara a un modo de adquisición de datos en video para que la luz admitida que incide sobre el arreglo CCD se muestre en tiempo real en la pantalla del ordenador.

Apague todas las luces ambientales de la habitación para reducir el ruido de fondo detectado por el arreglo CCD. Ajuste lentamente el micrómetro que controla la etapa de traslación en la dirección del eje óptico para colocar la muestra en el punto focal del haz láser. Cuando la muestra de fluoresceína esté enfocada, la emisión aparecerá como una línea nítida en el arreglo CCD.

Descargue la lectura de las intensidades de píxeles desde la matriz CCD al ordenador. Mida la intensidad de píxeles en función de la posición en la matriz CCD abriendo en ImageJ la matriz descargada de valores de intensidad y trazando una línea a través de la región fluorescente. Utilice el comando image day.

Analice el perfil del gráfico para crear una representación que ilustre el espectro de emisión de la muestra de fluoresceína. Ajuste el parámetro incremental del espejo, que controla el movimiento del láser. Enfóquese en la dirección Y, de manera que posiciones Y adyacentes dentro de la muestra provoquen el desplazamiento del pico de los espectros fluorescentes exactamente un píxel a lo largo de la dimensión espectral en la matriz CCD.

Para supervisar esto, descargue la intensidad de los espectros de fluoresceína en dos posiciones Y diferentes en la muestra. Luego, abra las imágenes de intensidad con ImageJ y determine la posición del píxel máximo para cada uno de los espectros fluorescentes. Utilizando el cursor de ImageJ, dejando la obturación del CCD abierta, desplace el enfoque del láser a través de la muestra en la dirección X.

La luz emitida por cada vóxel a lo largo de la línea del escaneo debe incidir sobre la matriz CCD al final de cada línea. Almacene los datos obtenidos de la matriz CCD para este escaneo de línea y luego limpie los píxeles de la matriz CCD. Mueva la posición del láser. Enfóquese en la dirección Y según la cantidad determinada anteriormente.

Luego, escanee el haz láser en la dirección X a través de la muestra. Nuevamente, dejando abierta la obturación del CCD, almacene los datos. Repita este procedimiento de escaneo por líneas hasta que un área física aproximadamente un 50 % mayor que las dimensiones de una sola célula biológica haya sido iluminada por la luz láser.

La relación entre el número de fila de una imagen específica de escaneo por líneas y la longitud de onda debe utilizarse para reconstruir las imágenes y obtener múltiples mapas faciales de intensidades fluorescentes ex-esposa a diferentes longitudes de onda. Para obtener la imagen de emisión fluorescente ex-esposa para una longitud de onda determinada, encuentre el número de fila en la imagen obtenida del primer escaneo por líneas que corresponda a esta longitud de onda. Luego, la fila adyacente de la imagen de escaneo por líneas subsiguiente corresponde a la siguiente fila de la imagen de emisión fluorescente.

Para esa longitud de onda particular, alinee todas las filas de la imagen que corresponden a esta longitud de onda para obtener los mapas espaciales de intensidad fluorescente XY de la muestra a esa longitud de onda. Repita este procedimiento para todas las demás longitudes de onda obtenibles para recopilar datos sobre sus muestras. Primero, retire de la incubadora las placas con colonias de levadura transformadas.

Debe haber al menos tres tipos de células transformadas. Células que expresan las proteínas de interés marcadas con ambos tipos de sondas fluorescentes. Células que expresan solo proteínas marcadas con las sondas fluorescentes donadoras y células que expresan solo proteínas marcadas con las sondas fluorescentes aceptoras.

Añada 100 microlitros de cloruro de potasio 100 milimolar a un tubo de microcentrífuga. Luego, utilizando una punta de micropipeta, raspe de tres a cinco colonias de levadura de la placa de células que expresan proteínas marcadas con ambos, donador y excepto una sonda fluorescente, e inocule el cloruro de potasio 100 milimolar. Con estas células, retire 10 microlitros de la suspensión celular y dispénselos sobre un portaobjetos microscópico nuevo.

Cubra la gota con un cubreobjetos y coloque una gota de aceite sobre la superficie del cubreobjetos. A continuación, cierre manualmente el obturador en la trayectoria del haz láser para bloquear la luz láser y evitar que llegue al objetivo del microscopio. Sujete la preparación microscópica al soporte de traslación XY, Z y desplace el soporte de la preparación en la dirección del eje óptico hasta que el objetivo del microscopio entre en contacto con la gota de aceite de inmersión.

Ahora encienda la iluminación de luz de campo amplio y diríjase a la cámara. Modo de video para la recopilación de datos. La imagen de campo amplio de la muestra estará severamente desenfocada debido a la presencia de la rejilla de transmisión en la trayectoria de emisión.

Por lo tanto, coloque un filtro de paso de banda con un ancho total en la mitad del máximo pequeño en la trayectoria óptica anterior a la rejilla de transmisión. Traduzca lentamente la etapa de traslación en la dirección del eje óptico mientras observa la imagen de las células en la pantalla de la cámara hasta que las células entren en enfoque. Desplace la etapa en la dirección X o Y para llevar una sola célula a la ubicación del enfoque del haz láser.

Apague la fuente de iluminación de campo amplio y retire el filtro de paso de banda del trayecto de emisión. Desbloquee el haz láser brevemente mientras observa simultáneamente la señal recibida en la matriz CCD. Si se detecta una señal fluorescente en la matriz CCD durante el tiempo en que el haz láser incide sobre la célula, realice un escaneo completo de adquisición de datos fluorescentes de esta célula.

Es fundamental utilizar los mismos parámetros de escaneo, específicamente el número de líneas y el incremento por qué, tal como se determinó en el procedimiento de calibración mostrado anteriormente. Repita el proceso de localización celular y adquisición de datos de fluorescencia para un gran número de células que expresan proteínas unidas tanto a las etiquetas donadoras como a las aceptoras. Después de acumular suficientes imágenes de fluorescencia de células que expresan proteínas marcadas con ambas etiquetas, repita todo el proceso tanto para células que expresan únicamente proteínas marcadas con las sondas fluorescentes donadoras como para células que expresan únicamente proteínas marcadas con las sondas fluorescentes aceptoras.

Finalmente, reconstruya todos los escaneos para obtener mapas espaciales de intensidad fluorescente XY resueltos espectralmente para cada conjunto de datos, utilizando el procedimiento descrito anteriormente. Las tres figuras ilustran los mapas espaciales resultantes calculados a partir de mediciones de microscopía de dos fotones resueltas espectralmente realizadas en una célula de levadura que expresa el receptor del factor alfa estéril. Los mapas bidimensionales de las señales del donador y del aceptor se obtuvieron analizando los perfiles de emisión espectral obtenidos de cada ubicación de la célula.

Se asignan colores falsos a las intensidades de fluorescencia según sus valores, y la escala se muestra como un recuadro insertado. Luego se calculó un mapa bidimensional de las eficiencias de FRET aparentes utilizando las imágenes KDA y KAD, a partir de los valores extraídos del mapa de eficiencias de FRET aparentes de la célula; justo después, se preparó un gráfico de histograma. Los valores medidos de EAPP de la célula están representados por círculos.

La línea roja continua representa el mejor ajuste a los datos medidos utilizando la suma de las funciones individuales de calcio representadas por líneas verdes continuas. El análisis del histograma, que se describe en el texto del protocolo, confirma que el complejo estéril del receptor de factor alfa dos con todos los ligandos asume la forma de un tetrámero con forma de RBA in vivo. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 12 horas si se lleva a cabo correctamente.

Al realizar este experimento, es importante mantener baja la potencia de la fuente de excitación. Es fundamental evitar la excitación múltiple del donador por un solo pulso.