Ensayo β-amiloide toxicidad con un transgénico C. elegans Modelo

El objetivo general del siguiente experimento es evaluar la toxicidad del péptido beta amiloide en un sistema modelo InVivo. La reproducibilidad y la relativa simplicidad de este ensayo permiten la prueba rápida de fármacos, condiciones ambientales o modificaciones genéticas sobre la toxicidad del beta amiloide. Un factor clave en el desarrollo de este ensayo es la generación de gusanos transgénicos de cl egan's con expresión inducible por temperatura específica en el músculo del péptido beta amiloide.

Esta expresión sensible a la temperatura se diseña mediante la construcción de un transgén que contiene una región no traducida tres prima anormalmente larga, haciendo que el ARNm del transgén sea un objetivo del sistema de vigilancia de ARNm. La expresión de este transgén es por lo tanto deficiente en gusanos silvestres con un sistema de vigilancia de ARNm funcional, debido a la degradación del ARNm del transgén. Si este transgén se introduce en un fondo genético que contiene una mutación en un componente esencial del sistema de vigilancia de ARNm, la expresión del transgén será significativamente mayor. Si el fondo genético contiene una mutación sensible a la temperatura en el sistema de vigilancia de ARNm, entonces el cultivo de esta cepa transgénica a la temperatura no permisiva bloqueará la degradación del ARNm del transgén y dará como resultado una alta expresión del transgén. Los gusanos transgénicos que emplean este sistema para regular la expresión en el músculo de la pared corporal del péptido beta amiloide, al aumentar la temperatura de 16 grados Celsius a 25 grados Celsius, presentan una alta acumulación del péptido beta amiloide, disfunción de las células musculares y parálisis de los gusanos. Medición del tiempo.

Se requiere una población de estos gusanos trenchgénicos para que se paralicen tras el aumento de temperatura. La prueba de sensibilidad al incremento térmico es un ensayo sensible para la toxicidad de beta amiloide. Esto se logra preparando placas frescas de medio de crecimiento para nematodos destinadas al ensayo de parálisis, lo cual ayuda a minimizar las variables ambientales que podrían influir en las tasas de parálisis.

Como segundo paso, se utilizan poblaciones de gusanos transgénicos sincronizadas por edad, lo que minimiza los efectos del estadio de desarrollo sobre la expresión del transgén. A continuación, los estadios larvales tercero sincronizados se transfieren de 16 grados Celsius a 25 grados Celsius, aumentando así la estabilidad del ARNm del transgén y provocando la acumulación del péptido beta amiloide. Medir el tiempo desde el cambio de temperatura hasta la parálisis de cada gusano permite captar la tasa de disfunción muscular, evaluando de este modo los efectos tóxicos de la acumulación del péptido beta amiloide; los resultados obtenidos muestran el efecto de tratamientos específicos sobre la toxicidad del péptido beta amiloide expresado endógenamente.

Por lo tanto, la principal ventaja de nuestra técnica, en comparación con el uso de modelos de ratones transgénicos para evaluar la actividad de fármacos, es que podemos realizarla mucho más rápidamente y a un costo mucho menor. La demostración visual de este método es fundamental. La calificación de gusanos L4 en un ensayo de parálisis es muy difícil de aprender.

Por lo tanto, cuando se evalúa un gusano paralizado en L4, lo que debe observarse es el movimiento aislado en halo de la región cefálica del gusano. Una vez que esta zona se mueve y todo el cuerpo del gusano está paralizado, se considerará que el gusano está paralizado. Los ensayos de parálisis se realizan en placas con medio estándar de crecimiento para nematodos o NGM, comúnmente utilizados para la propagación y estudios genéticos de C. elegans.

Para preparar las placas, autoclavar la solución de NGM que contiene cloruro de sodio, agar y péptido en un matraz erlenmeyer, luego añadir las cantidades adecuadas de las siguientes soluciones estériles que se encuentran en el protocolo escrito adjunto. Aliquotar 10 mililitros de NGM líquido en cada placa de Petri de 60 milímetros por 15 milímetros. Dejar solidificar el NGM durante la noche a temperatura ambiente.

Si se prueban los efectos de compuestos o extractos, alícuote el extracto en cada placa y utilice un espátula para distribuirlo uniformemente sobre la superficie de la placa. Deje las placas secar durante la noche a temperatura ambiente. Los volúmenes superiores a un mililitro requerirán más tiempo para secarse.

A continuación, coloque en cada placa 250 microlitros de la cepa de E. coli OP50 cultivada en medio LB durante la noche hasta una densidad óptica de 0,4 a 0,6, y deje secar las bacterias durante la noche a temperatura ambiente. La edad de la placa tiene un efecto significativo en la tasa de parálisis, y las placas más antiguas tienden a deshidratarse. Las placas deben prepararse no más de una semana antes del ensayo de parálisis.

Idealmente, se deben usar placas que hayan sido preparadas de tres a cuatro días antes. Las placas con huevos sincronizados utilizadas en cualquier experimento deben provenir todas del mismo lote. Modificar el tamaño del césped bacteriano y/o la cepa bacteriana también alterará el comportamiento de los gusanos. Los ensayos de parálisis pueden realizarse utilizando cepas alternativas de E. coli. Por ejemplo, HT115 se utiliza en experimentos de RNAi. Sin embargo, esto podría modificar la cinética del ensayo de parálisis.

Por lo tanto, debe utilizar controles internos que sean cepas adecuadas. CL 476 es la más utilizada comúnmente para ensayar una parálisis inducida por beta. Esta cepa y otros modelos transgénicos están disponibles para investigadores académicos por una tarifa nominal en el Centro Genético Saint Ahadi.

Para maximizar la sincronía de edad de la población de prueba, es preferible comenzar con una generación parental sincronizada. Una semana antes de iniciar el ensayo de parálisis de la población de prueba, utilice un aplicador de lombrices de platino para transferir de 20 a 30 adultos jóvenes a varias placas de NGM de 10 centímetros.

Extender con OP 50 para un periodo de puesta de huevos de dos horas a 16 grados Celsius, que es la temperatura permisiva para CL 4 1 76. Retirar los adultos GR y permitir que la descendencia crezca durante siete días, tiempo en el cual alcanzarán la etapa de adultos de segundo día. Segundo día de gravedad.

Los adultos se utilizan para preparar poblaciones de prueba sincronizadas por edad para cada condición experimental. El objetivo es generar placas por triplicado que contengan entre 50 y 75 gusanos sincronizados por edad, utilizando un aplicador de gusanos de platino. Transfiera 10 a 12 adultos de dos días de edad a placas NGM de 60 milímetros con manchas de OP50. Deje que los gusanos depositen huevos a 16 grados Celsius durante dos horas, luego retire los adultos y permita que los huevos eclosionen y crezcan a 16 grados Celsius.

En este momento, lo mejor es que una persona que no vaya a puntuar las placas las codifique, de modo que la evaluación sea ciega respecto a las condiciones experimentales. La fase del desarrollo embrionario en la que se ponen los huevos, que es aproximadamente la fase de 26 células para gusanos de tipo salvaje en condiciones óptimas, depende de la edad y la nutrición de los adultos. Si los adultos de gravedad utilizados para la puesta de huevos son más viejos o están privados de alimento, se pondrán huevos en fases más avanzadas y no se logrará una población sincrónica, lo que afectará la cinética del ensayo de parálisis.

Es esencial utilizar cultivos bacterianos monogénicos como e coli, OP 50, ya que cualquier contaminación bacteriana puede afectar gravemente este ensayo. La reproducibilidad es mayor si sus placas triplicadas tienen un número similar de gusanos para inducir el transgén y llevar a cabo el ensayo de parálisis. Eleve las placas a 25 grados Celsius.

48 horas después del final de la puesta sincrónica de huevos, los gusanos deben estar en la tercera etapa larval. Las placas deben colocarse sin apilar en un incubador a 25 grados Celsius para permitir que alcancen esta temperatura. Al mismo tiempo, comience a evaluar la parálisis de los gusanos entre 18 y 20 horas después de que se haya iniciado el aumento de temperatura.

En este momento, todos los gusanos de la población deberían haber alcanzado la cuarta etapa larval; continúe evaluando en incrementos de dos horas hasta que todos los gusanos en cada placa estén paralizados. Por razones desconocidas, la parálisis no es uniforme a lo largo de la longitud del cuerpo. La región cefálica es la última parte del gusano en dejar de moverse.

Por lo tanto, los gusanos que han iniciado recientemente la parálisis no pueden desplazarse a través de la placa, pero pueden mover sus cabezas, despejando así las bacterias alrededor de su extremo anterior y dejando un halo de bacterias eliminadas. Estos gusanos inevitablemente se paralizarán por completo y, por lo tanto, los gusanos con halos se clasifican como paralizados. Algunos gusanos no tendrán halos, pero tampoco mostrarán movimiento espontáneo.

Estos se prueban presionándolos con el recolector de gusanos. Si un gusano presionado no puede realizar la propagación completa de ondas corporales tras la presión, también se califica como paralizado para facilitar la puntuación. Es más sencillo mover los gusanos paralizados a un sector sin manchas del plato para que no sean recalificados accidentalmente en el siguiente período de puntuación.

Esto también permite que los gusanos mal clasificados muestren movimiento, lo que posibilita una corrección en la puntuación para generar una curva de parálisis. En cada punto temporal, la fracción de gusanos en cada placa que no han sido paralizados se convierte en un porcentaje, y el porcentaje promedio no paralizado se grafica frente al tiempo a partir del momento en que se inició el cambio de temperatura. La curva resultante es formalmente análoga a una curva de supervivencia y, por lo tanto, puede analizarse utilizando estadísticas estándar no paramétricas de supervivencia.

El cambio a temperatura elevada de los gusanos transgénicos myo tres A beta debe realizarse a mediados del estadio L cuatro para que se inicie la parálisis. El promotor Myo tres está regulado durante el desarrollo. Una vez que los gusanos han alcanzado el estadio L cuatro tardío o la edad adulta, el nivel de expresión ha disminuido significativamente.

La expresión del transgénico se bloquea si los gusanos se privan de alimento, por lo que es muy esencial que los gusanos estén bien alimentados durante todo el experimento. Nunca hemos observado que un gusano paralizado se recupere bajo ninguna condición. Después de 12 a 16 horas de aumento de temperatura, CL 41 76 quedará paralizado, independientemente de si se reduce la temperatura a 16 grados; en la cepa CL 41 76, la sobreexpresión de la expresión del transgénico que causa la parálisis puede ocurrir a temperaturas más bajas.

Sin embargo, tenga en cuenta que la tasa de parálisis se verá afectada en cuanto a su momento. La tasa de parálisis depende de la cepa transgénica específica utilizada. Hemos construido tres cepas de myo A beta que presentan una tasa de parálisis más rápida y más lenta que la CL 41 76, y por lo tanto, debe ajustar su ventana de puntuación para el ensayo de parálisis en consecuencia.

Se muestra aquí un gráfico de una curva de parálisis para CL 4 1 76, tanto sin tratar como expuesto a cafeína 6,27 milimolar. Este tratamiento provoca un retraso altamente significativo desde el punto de vista estadístico en la parálisis de aproximadamente cuatro horas, lo que interpretamos como indicativo de una supresión de la toxicidad beta. En este modelo, este experimento evaluó los efectos de ol, otro compuesto presente en el café.

El gráfico es típico para tratamientos que no afectan la toxicidad beta. Obsérvese que en ambos experimentos, aproximadamente la mitad de las poblaciones no tratadas de CL 4 1 76 están paralizadas a las 24 horas y la parálisis es completa a las 28 horas. Estos son los plazos típicos para la parálisis del control.

Las poblaciones CL 4 1 7 6 presentan desviaciones significativas respecto a este momento, lo que indica condiciones ambientales alteradas o la eliminación espontánea de copias del transgén. Consulte el protocolo adjunto para obtener información adicional sobre la cepa CL 4 1 76. Al realizar este procedimiento, es importante tener en cuenta la edad de las placas, el estadio de la población de gusanos y la capacidad de cuantificar la tasa de parálisis de los gusanos.

Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo utilizar este sistema de gusanos marinos para evaluar cuidadosamente la toxicidad de beta amiloide. Debería ser capaz de detectar efectos bastante sutiles sobre esta toxicidad provocados por diversos tratamientos ambientales o farmacológicos. Las variables que hemos mencionado son importantes para tenerlas en cuenta, ya que le permitirán realizar el ensayo de manera muy reproducible y con una cinética de parálisis consistente.

Esto es realmente muy importante si desea comparar sus resultados obtenidos en su laboratorio en diferentes momentos y por diferentes personas, o si desea comparar sus resultados con los de otros investigadores que utilizan este sistema de modelo.