Bloque de agar-microcosmos de descomposición controlada de Tejidos Vegetales de hongos aerobios

El objetivo general de este procedimiento es inocular un hongo aeróbico degradador de madera en un microcosmos de placa de Petri en el que la humedad de la madera y los sustratos exógenos están estrictamente controlados. Esto se logra primero preparando microcosmos con volúmenes exactos de medios conocidos. Luego, la madera que se va a degradar, y cualquier sustrato sólido exógeno, se colocan encima de una rejilla de plástico sobre la superficie de agar sin permitir el contacto entre los sustratos.

A continuación, se inocula e incuba el microcosmos con el hongo de prueba. Tras la incubación, se recolectan los bloques de madera para determinar la pérdida de masa y preparar los tejidos para análisis. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran el grado de biodegradación de la madera y el papel de las fuentes exógenas de elementos mediante mediciones de pérdida de masa, observaciones de la morfología del micelio y análisis elementales específicos, como la espectroscopía de plasma acoplado inductivamente.

Hola, mi nombre es Brooke Jacobson del laboratorio del Dr. Jonathan Schilling en el Departamento de Ingeniería de Biotecnología y Biosistemas de la Universidad de Minnesota. Hoy les mostraremos un procedimiento para utilizar placas de Petri como microentornos para la descomposición de tejido vegetal por hongos aeróbicos. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar los mecanismos de descomposición fúngica de la lignocelulosa.

La lignocelulosa es el tejido vegetal compuesto por lignina, celulosa y hemicelulosa. El tejido que estudiamos con mayor frecuencia es la madera; los errores relacionados con los aspectos menos técnicos del diseño del bloque de husillo son las causas más comunes de fallos y las principales fuentes de variabilidad entre estudios, lo que hace útil la publicación en video de nuestra configuración del bloque de husillo. Sabemos por experiencia que este procedimiento produce resultados de alta calidad y baja variabilidad.

Así que comencemos. Para estos experimentos, utilice placas de Petri que sean un centímetro más profundas que las placas de Petri típicas, para aumentar el espacio de cabeza sobre el bloque de madera en el microcosmos.

Comience la preparación del microcosmos preparando suficiente medio para 20 mililitros por placa de Petri libre de calcio y hierro. Pese 15 gramos de agar tipo A y colóquelos en un matraz aforado de 500 mililitros que contenga aproximadamente 400 mililitros de agua desionizada enriquecida con suplementos. Utilice soluciones stock previamente preparadas para añadir micronutrientes a la mezcla.

Una vez añadidos los nutrientes, complete el matraz aforado hasta la línea de 500 mililitros. A continuación, transfiera el medio a un matraz de 1000 mililitros. Esterilice en el autoclave a 121 grados Celsius y 16 PSI durante 20 minutos.

Tenga cuidado de no exceder un volumen de 500 mililitros por frasco para evitar que el agar se solidifique antes de administrar las placas de prueba. Después de la autoclave, deje enfriar el medio al tacto para minimizar la condensación. Minimizar la humedad es fundamental en estos experimentos, ya que el contenido de humedad o mc.

Más del 80 % provocará anoxia en los tejidos. Limite la descomposición por hongos aeróbicos y aumente la variabilidad una vez. Enfríe. Utilice una pipeta portátil con ayuda mecánica y pipetas estériles de poliestireno de 10 mililitros de manera aséptica.

Transfiera el agar a una pila alta de placas dentro de una cabina de seguridad biológica. A continuación, corte generosamente rejillas de malla plástica para que encajen dentro de las bases de las placas. Después de cortar y lavar minuciosamente las rejillas con agua y jabón, prepárelas para secar y esterilizar en autoclave para esta demostración.

La pino amarillo del sur o SYP se utiliza porque representa una fuente importante de madera aserrada. En la construcción de viviendas en los EE. UU., use madera no tratada y corte bloques libres de nudos de 19 por 19 milímetros mediante un único corte longitudinal siguiendo la veta. Corte esta longitud en bloques cúbicos de 19 milímetros.

Divida los bloques de 19 milímetros cúbicos por la mitad a lo largo del veteado utilizando un cincel y un martillo en lugar de una sierra. Esto crea un borde áspero del bloque que se colocará hacia abajo sobre la malla plástica en el microcosmos del bloque agrícola y un borde superior liso para etiquetar. Etiquete el borde liso de los bloques con un lápiz, corte suficientes bloques para satisfacer los tratamientos, así como los controles no inoculados que servirán tanto como monitores de contaminación como muestras de datos de línea base acondicionadas en paralelo con material secado en horno; coloque las muestras en bandejas de aluminio para suero de leche y en un horno de convección a 100 grados Celsius durante 48 horas.

Transfiera las muestras del horno a un desecador para enfriarlas una vez. Enfríe. Pese previamente las muestras para determinar el peso seco inicial en el horno. Finalmente, prepare las muestras, incluyendo las rejillas de plástico y la madera, para la autoclave envolviéndolas firmemente con papel de aluminio para minimizar la humedad.

Esto no requiere que cada muestra sea envuelta individualmente, sino que la exposición al vapor sea baja y constante. Autoclave las muestras etiquetadas a 121 grados Celsius y 16 PSI durante una hora. En una cabina de seguridad biológica estéril, ensamble AE vacíos, una placa fuente para sustrato vegetal de malla de inóculo materiales exógenos, tiras de paraformaldehído, pinzas y herramientas de transferencia.

El siguiente paso de la inoculación consiste en agregar los elementos al agar, manteniendo los cultivos en las placas de Petri para minimizar el riesgo de contaminación. Flamear las herramientas de transferencia y las pinzas con etanol al 95 % conforme se utilizan. Primero, añadir la malla plástica a la placa de Petri.

Luego agregue el sustrato de madera aquí. Se añaden dos bloques de madera a lo largo del largo de la malla para que los datos puedan emparejarse a partir de las cosechas tempranas y tardías. Estos bloques se colocan uno al lado del otro con la veta y orientados hacia el punto de origen del inóculo fúngico.

A continuación, agregue los materiales exógenos aquí. Se está evaluando el papel del yeso en la descomposición provocada por un hongo filamentoso. Por lo tanto, el hongo debe encontrar estos discos de yeso antes de llegar a la madera.

Se añade un disco de yeso entre cada bloque y el punto de inóculo en la parte superior de la malla. Tenga cuidado de evitar el contacto entre los discos dentro de la madera, manteniéndolos al mismo tiempo lo más cercanos posible. Para el inóculo fúngico, utilice un sacabocados número cuatro con un diámetro de siete milímetros para obtener cilindros de cultivos de dos semanas crecidos en 20 mililitros de agar.

Esto ayuda a controlar el volumen del inóculo. Para los controles no inoculados, lo mejor es añadir un trozo de un plato estéril. No permita el contacto entre el inóculo y los sustratos exógenos o la madera, pero colóquelos cercanos entre sí.

Utilice un tapón de inóculo por bloque. Selle los recipientes con param que haya sido cortado con una cuchilla, mantenga las placas en posición horizontal y envuelva el param en un movimiento suave y continuo. Finalmente, etiquete las tapas de los recipientes utilizando un marcador resistente al alcohol, indicando los números de los bloques directamente sobre los sustratos correspondientes.

También dibuje círculos sobre los discos de yeso. Transfiera las placas cuidadosamente a una incubadora biológica para evitar movimientos bruscos del contenido y minimizar la condensación debida a fluctuaciones de temperatura. Las condiciones utilizadas aquí son de 20 grados Celsius y en la oscuridad; realice cosechas en serie temporal de forma aséptica, excepto la última cosecha.

En el punto de recolección de la semana cinco, retire todo el lote de tratamiento. Rocíe cada parte inferior y superior con etanol al 70 % y utilice pinzas flameadas para retirar el material dentro del gabinete de seguridad biológica. Tome fotografías antes de destruir las placas agrícolas, centrándose en cualquier morfo F o melón.

Luego retire los bloques que se van a tratar. Retire cualquier exceso de faga, pero tenga cuidado de no perder ningún material descompuesto en el horno. Seque los bloques en bandejas de aluminio y determine la pérdida de masa utilizando los pesos fresco y seco de los controles para monitorear una absorción excesiva.

Los datos de pérdida de masa ayudan a evaluar el progreso de la descomposición y son información importante. Si se van a calcular las concentraciones elementales en base al peso en gramos, los datos porcentuales deben normalizarse. Para fines estadísticos, etiquete y siga cualquier bloque de color pardo oscuro, que evidentemente esté anegado de agua.

Finalmente, destruya los cultivos en bolsas autoclavables, guardando la malla de soporte de plástico y cualquier otro componente que pueda reciclarse para su uso en futuros experimentos. Mediante el montaje del microcosmos de bloques agrícolas, los bloques de madera de pino descansan sobre una malla de plástico para elevarlos por encima del contacto con el sustrato agrícola. Los hongos circulares crecieron en contacto directo con las superficies de yeso y penetraron dentro de los bloques de madera.

Este micelio representa una conexión importante entre la madera y las fuentes exógenas de elementos nutritivos. El control de estas fuentes de materiales exógenos en agar o en materiales sólidos es una ventaja clave del diseño de bloques agrícolas frente al diseño de bloques de suelo, utilizando la pérdida porcentual media de peso como medida del grado de descomposición de la madera por *Ser crain's* tras cinco y 15 semanas. Aquí se muestra la incubación con pino en microcosmos de bloques agro.

No se aplicaron tratamientos. Se agregó cloruro de calcio 5 mM al agar, mayor del 99 % de yeso puro o yeso suplementado con 1 % de hierro para cada cosecha; las barras con la misma letra no son significativamente diferentes. Con las barras de error representando la desviación estándar, se observó una pérdida de peso superior al 60 % en los bloques de pino marrón podrido del testigo, lo que satisface el objetivo establecido por la Sociedad Americana de Pruebas y Materiales de una descomposición mayor al 50 %.

El coeficiente promedio de variación en la descomposición fue de 0,055 en la semana 16. Además de la baja variabilidad, se observó un efecto del tratamiento. La descomposición fúngica se inhibió con la adición de calcio, ya fuera al agar como cloruro de calcio o como yeso puro.

Curiosamente, las tasas de descomposición se recuperan con la adición de hierro al yeso. Esto sugiere que el hierro, no el calcio, es fundamental para observar las cinco réplicas en la semana 15 de descomposición. Mediante el mismo hongo de pudrición parda, hongos de prueba, láminas circulares, el color de los micelios revela mein.

Diferencias en hifas externas entre tratamientos; se retiraron los bloques y se colocaron hacia arriba y se secaron. Revelando la falta de mein en el tratamiento sin calcio. El amarilleo en los tratamientos con calcio puro y el aspecto de óxido en el tratamiento suplementado con hierro.

El control representa bloques no inoculados para su comparación. Curiosamente, los efectos principales desaparecen al utilizar un medio con alto contenido de hierro. En conjunto, esto sugiere que este hongo utiliza hierro, no calcio.

En estos materiales, le hemos mostrado cómo utilizar un montaje con bloque de sacacorchos para evaluar con éxito la biodegradación de tejidos vegetales por hongos filamentosos aerobios. Al realizar este procedimiento, es importante recordar mantener los sustratos separados entre sí, especialmente el tejido vegetal y el sacacorchos, minimizar el contenido de humedad del sacacorchos y de las plaquetas, y verificar nuevamente que el contenido de cada placa no se haya desplazado antes de la incubación. Teniendo en cuenta estas variables, puede controlar el entorno de descomposición mucho mejor de lo que sería posible utilizando un montaje con bloque de suelo.

Puede generar datos con una potencia estadística necesaria para responder sus preguntas de investigación. Eso es todo. Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.