De cristalización de proteínas para la cristalografía de rayos X

El objetivo general de este procedimiento es producir cristales de proteínas para experimentos de difracción de rayos X. Se demuestran tres técnicas diferentes para el cribado de cristales: métodos de cristalización por difusión de vapor, que incluyen gota colgante y gota apoyada, así como métodos de cristalización en microbatch. Los pocillos se llenan con agente precipitante.

Luego, una alta concentración de la muestra de proteína purificada se mezcla con el agente precipitante. La gota mezclada se sella entonces en un pocillo que contiene la solución precipitante. La cristalización en microbatch comienza llenando el pocillo con aceite de parafina.

La proteína se carga entonces en los pocillos, seguida por la solución precipitante. El paso final de todos los métodos consiste en dejar que el sistema alcance el equilibrio y seguir la aparición y el crecimiento de los cristales dentro de las gotas. Finalmente, se pueden obtener cristales mediante esta técnica y se puede determinar el patrón de difracción de la proteína utilizando una fuente de rayos X con un detector adecuado.

Hola, soy Sal del laboratorio del profesor Yoga Motis en el Departamento de Biofísica y Bioquímica Molecular de la Universidad de Yale. Hoy les mostraremos un procedimiento para la cristalización de una proteína purificada. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para estudiar la base estructural de la infección viral.

Así que comencemos y cultivemos algunos cristales. Para identificar un método de cristalización para una macromolécula de interés, se pueden realizar cribados iniciales utilizando soluciones de cristalización disponibles comercialmente, seleccionadas para aprovechar el método de matriz dispersa factorial incompleto de condiciones experimentales. Estas condiciones se eligen en función de condiciones de cristalización conocidas y comúnmente exitosas para macromoléculas.

Una vez conocida la condición de cristalización, se puede armar una batería estrecha variando la concentración del agente precipitante y el pH alrededor del primer resultado positivo. Por lo general, las condiciones de cristalización utilizadas en estas baterías consisten en un agente precipitante y un tampón para ajustar el pH; todas las soluciones stock deben filtrarse mediante un filtro de 0,22 micrones para esta demostración. Se utilizan las condiciones de cristalización previamente identificadas para la lisozima de pollo, empleando cloruro de sodio como agente precipitante; comience el procedimiento preparando soluciones de un mililitro con diversas concentraciones de cloruro de sodio en acetato de sodio 0,1 molar y diferentes valores de pH.

A continuación, descongele la muestra de proteína que se almacenó a menos 80 grados Celsius y manténgala en hielo. Las concentraciones típicas de proteína se encuentran en el rango de cinco a 50 miligramos por mililitro, siendo las concentraciones más altas las que generalmente dan mejores resultados. Aquí, se utiliza una solución de 50 miligramos por mililitro de lisozima de huevo de gallina en acetato de sodio 0,02 molar, pH 4,9.

Centrifugar la muestra durante 15 minutos a 18.000 G y cuatro grados Celsius para eliminar cualquier proteína parcialmente agregada o precipitado procedente del paso de descongelación. Estos agregados pueden interferir con el crecimiento de cristales y promover una mayor agregación. Tras la centrifugación.

Determine la concentración de proteína a partir de su absorbancia a 280 nanómetros utilizando un espectrofotómetro UV. La concentración de proteína puede calcularse a partir de la lectura de absorbancia y del coeficiente de extinción de la proteína. Una vez que la muestra de proteína esté lista, llene una placa de cristalización de gota colgante en pocillo de 24 pocillos con 500 microlitros de solución precipitante según el mapa de la placa.

Cree un anillo de grasa de silicona alrededor del borde de cada pocillo sin cerrar perfectamente el anillo, para que el aire pueda escapar al colocar la tapa. Limpie la lámina cubreobjetos con aire comprimido en aerosol o con una toallita profesional para evitar el polvo, lo cual facilitará la interpretación de las gotas de cristalización y eliminará contaminaciones. El siguiente paso consiste en pipetear volúmenes iguales de la muestra de proteína y de la solución del depósito sobre la lámina cubreobjetos.

Sin embargo, pueden probarse diferentes volúmenes de proteína y precipitante como parte del proceso de optimización; usar más proteína que precipitante da como resultado una concentración neta de la proteína en la gota equilibrada, lo cual puede ser deseable para muestras de proteína diluidas o para ralentizar la nucleación o el crecimiento de los cristales. Para esta demostración, se cargan dos microlitros de lisozima al 50 miligramos por mililitro en acetato sódico 0,02 molar, pH 4, en el centro del cubreobjetos, seguidos de dos microlitros de la solución de cristalización.

Al pipetear la solución proteica y la solución de reserva sobre la cubeta, tenga extremo cuidado para evitar la formación de burbujas, lo cual ocurre frecuentemente cuando se expulsa aire del interior de la pipeta. Mezcle suavemente la gota para ayudar a prevenir la precipitación prematura de la proteína debido a concentraciones localmente altas de agente precipitante; esta mezcla es particularmente importante para agentes precipitantes viscosos como el polietilenglicol, utilizando pinzas. Invierta suavemente la cubeta y colóquela sobre el anillo de grasa en la parte superior del pocillo; realice este paso de manera direccional para permitir que el aire escape del pocillo.

De lo contrario, el aire puede levantar la cubeta, comprometiendo el sellado del pocillo. Pase al siguiente pocillo hasta completar la bandeja. Una vez preparada la bandeja, inspecciónela visualmente para eliminar partículas de polvo y otros contaminantes que podrían aumentar la identificación falsa positiva de cristales de proteínas.

Utilice una hoja de evaluación para documentar el experimento. A continuación, coloque la bandeja a la temperatura deseada de incubación, generalmente entre cuatro grados Celsius y la temperatura ambiente. La temperatura más exitosa es 20 grados Celsius.

Tenga cuidado de manipular la bandeja con suavidad y evitar cualquier vibración o cambio de temperatura durante la transferencia o la incubación, ya que esto puede prevenir el crecimiento de cristales o afectar negativamente la calidad de los cristales. Revise la bandeja en busca de cristales al día siguiente y luego cada pocos días, manipulando siempre las bandejas con cuidado. Documente cualquier hallazgo y las morfologías de las gotas en una hoja de puntuación específica para la bandeja.

Los cristales suelen tardar de dos a cinco días en aparecer, aunque en ocasiones pueden formarse casi inmediatamente o incluso hasta varios meses después. Una vez identificadas las condiciones de cristalización y conocida la velocidad de crecimiento de los cristales, lo mejor es no molestar las bandejas hasta que los cristales hayan aparecido y crecido al menos hasta la mitad de su tamaño final. Mantener las bandejas sin alterar puede reducir el número de eventos de nucleación, lo que resulta en un menor número de cristales más grandes. Para la cristalización por gota sedimentada, siga el mismo procedimiento que para la gota colgante, excepto que utilizaremos una bandeja de 24 pozos para gota sedimentada, en la cual no se requieren cubreobjetos.

En cambio, el pocillo contiene un estante en el que se mezclan la proteína y el precipitante con una pipeta; coloque dos microlitros de una solución de lisozima al 50 miligramos por mililitro en el centro del estante, evitando la formación de burbujas de aire. A continuación, agregue dos microlitros de solución precipitante a la muestra después de configurar la bandeja. Selle los pocillos con cinta óptica mediante la técnica de gota sedimentada.

No son necesarios portaobjetos de cobertura. Continúe la incubación y la evaluación de los cristales como se describió para la gota colgante. Para realizar un procedimiento de microbatch.

Prepare la solución de cristalización y la proteína según se describe para el procedimiento de gota colgante. Obtenga una nueva bandeja para microbatch y use un aerosol de aire para evitar el polvo y otras partículas grandes en la bandeja de microbatch. Añada aceite de parafina a cada pocillo hasta una profundidad de tres milímetros.

Luego, retire el exceso de aceite. A continuación, cargue un microlitro de la solución de proteína en el pozo previamente lleno, asegurándose de que la gota se hunda hasta el fondo del pozo. Luego, cargue un microlitro de la solución de precipitante en el pozo.

Asegúrese de que la gota se hunda hasta el fondo del pocillo y se fusione con la gota de proteína. Pase al siguiente pocillo hasta completar la placa y continúe con la incubación y el análisis de cristales según se describe aquí. Resultados típicos de la cristalización de proteínas.

Se muestran experimentos. La precipitación amorfa ocurre cuando la proteína y/o el precipitante se encuentran en alta concentración. Por el contrario, las gotas que están insaturadas generalmente permanecen claras.

La separación de fases puede ocurrir si la proteína o el detergente se separa en una fase diferente cuando se mezcla con ciertos precipitantes a alta concentración. En condiciones óptimas, los cristales de proteína deben formarse en Arabidopsis csn. Siete cristales de proteína obtenidos en polietilenglicol 8,000 y acetato de magnesio tienen forma de varilla.

Los cristales que también se muestran son cristales de proteínas de lisosomas obtenidos en una molaridad de cloruro de sodio y acetato de sodio, pH 4,9. Esta película cronometrada demuestra que los cristales de lisosomas crecen formando grandes prismas en cuestión de pocas horas tras el montaje, al utilizar el método de la gota colgante.

Acabamos de mostrarle cómo configurar un experimento con proteínas cuando realiza este procedimiento. Es importante trabajar en un entorno con control constante de temperatura y humedad, ya que una humedad elevada ayuda a minimizar la evaporación de la gota; intente adoptar una técnica que reduzca al mínimo la exposición de la gota al aire libre. Por esta razón, es fundamental trabajar en un entorno organizado.

Así que eso es todo. Gracias por ver este video y buena suerte con sus experimentos.