Estrategia de transfección optimizados para la expresión y el registro electrofisiológico de los canales iónicos recombinantes del voltaje en las células HEK-293T

La electrofisiología se utiliza comúnmente para estudiar la actividad de canales iónicos regulados por voltaje recombinantes en células de riñón embrionario humano cultivadas. Para obtener grabaciones exitosas, es necesario que las células expresen los canales a niveles suficientes en la membrana celular para su detección y que se siembren a una densidad celular lo suficientemente baja como para aislar células individuales. La realización de grabaciones celulares se ve frecuentemente obstaculizada por los largos períodos de incubación a 28 grados Celsius necesarios para dicha expresión, durante los cuales suele producirse una pérdida de adhesión celular y estabilidad de la membrana.

Aquí se muestra un método optimizado para el cultivo celular y la transfección que evita estos problemas. Las células se transfectan a una confluencia moderada, luego se incuban a 28 grados Celsius hasta alcanzar una expresión adecuada de canales iónicos. A continuación, las células transfectadas se siembran sobre cubreobjetos de vidrio a baja densidad y se incuban a 37 grados Celsius durante varias horas para permitir la adhesión celular y la estabilización de la membrana.

Una vez que las células adecuadamente sembradas se identifican mediante la coexpresión de EGFP y el registro mediante parche de célula completa. Se puede realizar la grabación o las células pueden incubarse nuevamente a 28 grados Celsius. Para aumentar aún más la expresión en la superficie de los canales, los resultados de los experimentos de registro en células transfectadas con canales de calcio activados por voltaje, como L CAV uno, L CAV dos o L cav tres, indican que los canales han sido transfectados y expresados con éxito por las células.

Aunque solo se muestran resultados representativos para L CAV tres en nuestro laboratorio, hemos desarrollado un método para aumentar la expresión de genes de canales iónicos de baja expresión para grabaciones de parche en líneas celulares humanas. El enfoque convencional consiste en separar primero las células sobre laminillas y transfectarlas con ADNc plasmídico que contiene los genes de los canales iónicos, seguido de una incubación durante varios días a 28 grados Celsius para lograr una expresión eficiente de los canales iónicos antes de la grabación electrofisiológica. Nuestro nuevo enfoque reduce considerablemente el tiempo de incubación necesario a 28 grados Celsius antes de la grabación.

Ahora, al reducir el tiempo de incubación a 28 grados, observamos que las membranas celulares son mucho más estables y que las células transfectadas se adhieren mucho mejor a las laminillas. Esto aumenta el número de células registrables y hace que la experimentación sea significativamente más eficiente. Antes de la transfección, divida un matraz completamente confluyente de células HEK 2 9 3 T, en una proporción de uno a cuatro, en un nuevo matraz de 25 centímetros cuadrados y coloque las células en un incubador a 37 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono.

Deje que las células se adhieran durante tres o cuatro horas; después de cuatro horas, examine las células mediante contraste de interferencia diferencial para verificar la adhesión. Observe que las células ya no tienen aspecto redondeado y se están aplanando. Son visibles extensiones o pseudópodos.

Las células con menor confluencia tendrían el mismo aspecto pero estarían más separadas entre sí. Una vez que las células se hayan adherido, combine los reactivos necesarios para realizar una transfección estándar con fosfato de calcio. Prepare un total de 12 microgramos de ADN en 600 microlitros de solución de transfección por frasco.

Aquí, los ADNc de diversos canales iónicos se clonan en el plásmido P-I-R-E-S con dos EGFP. La transfección de este vector de expresión en una línea celular de mamífero da como resultado la producción de proteína verde fluorescente mejorada a partir del mismo ARNm que el inserto clonado, mediante una traducción iniciada en un sitio interno de entrada de ribosomas localizado justo aguas abajo de la secuencia codificante del canal iónico y aguas arriba de la secuencia codificante del EGFP. Esto permite identificar las células transfectadas positivamente sin posibles interferencias en la función proteica que podrían surgir al fusionar directamente la proteína EGFP con la proteína de interés.

Pipetee la solución de transfección sobre las células gota a gota, luego agite suavemente el matraz y colóquelo en el incubador a 37 grados Celsius durante la noche hasta el día siguiente. Verifique la eficiencia de transfección observando las células bajo un microscopio de fluorescencia. Las células transfectadas positivamente deben aparecer verdes en toda la célula.

Una vez que se haya verificado la transfección, pipetee cuidadosamente de cuatro a cinco mililitros de medio tibio en el frasco invertido. Lave las células girando lentamente el frasco boca abajo de manera que la superficie celular quede hacia abajo, y mueva suavemente el frasco para que la solución de lavado recorra las células con delicadeza. Retire el medio y repita este lavado.

Repita el paso dos veces más. A continuación, agregue seis mililitros de medio al matraz e incube a 37 grados Celsius durante dos horas. La expresión de canales iónicos de invertebrados presenta algunos desafíos.

Primero, a menudo son de gran tamaño y, por lo tanto, pueden tardar mucho tiempo en traducirse en el retículo endoplasmatico. Además, es posible que no se dirijan eficientemente a la membrana celular en una línea celular de mamífero. Por último, dado que diferentes especies presentan frecuencias distintas de uso de codones, los ADNc heterólogos pueden contener frecuencias altas de codones poco comunes en células de mamíferos, como las HEK 293T, para superar algunas de estas dificultades.

Tras la incubación de dos horas a 37 grados Celsius después de la transfección y el lavado, transfiera los matraces a un incubador a 28 grados Celsius durante dos a seis días para prolongar el período de expresión. El tiempo de incubación debe determinarse empíricamente para cada tipo de canal iónico que se exprese. Dado que la incubación a 28 grados Celsius durante períodos prolongados provoca la desprendimiento celular y una pobre estabilidad de la membrana.

Se necesita una preparación adicional de las células antes de realizar estudios electrofisiológicos. Primero, retire el medio de las células transfectadas mediante pipeta de aspiración, agregando un mililitro de solución de tripsina a 37 grados Celsius en un frasco invertido. Luego, regrese suavemente el frasco a la posición con la superficie celular hacia abajo para permitir que la tripsina fluya suavemente sobre las células.

Dar la vuelta al matraz nuevamente y eliminar la tripsina. A continuación, añadir 250 microlitros de tripsina tibia directamente sobre las células e incubar a 37 grados Celsius durante tres a cinco minutos hasta que las células se desprendan. Mientras tanto, colocar de tres a ocho laminillas recubiertas con poli-L-lisina en una placa de cultivo de 60 milímetros y añadir cinco mililitros de medio de cultivo tibio.

Una vez que las células se hayan desprendido, suspenda las células en cuatro mililitros de medio tibio pipeteando hacia arriba y hacia abajo aproximadamente seis veces. A continuación, utilizando la punta de la micropipeta, presione hacia abajo las laminillas para asegurarse de que estén en el fondo del recipiente. Luego agregue de 250 a 500 microlitros de células resuspendidas. Incube las células a 37 grados Celsius durante tres horas para permitir que se adhieran a las laminillas.

Dejar las células durante demasiado tiempo a 37 grados provocará la división celular y la dilución de los plásmidos transfectados. Las células transfectadas deben sembrarse a una densidad suficientemente baja para que estén aisladas unas de otras, como se muestra aquí. Esto facilitará el registro electrofisiológico.

Para las células que requieren subunidades accesorias, a menudo es necesario transferir las células a 28 grados Celsius e incubarlas durante tres o cuatro días adicionales antes de la electrofisiología. El registro se lleva a cabo en células que no requieren subunidades accesorias. La grabación puede realizarse inmediatamente después de esta incubación.

El equipo de electrofisiología utilizado aquí incluye un amplificador, manipuladores de micropipetas duales motorizados, un microscopio de fluorescencia epiluminiscente y sistemas de perfusión. El equipo ha sido montado sobre una mesa de aislamiento de vibraciones y ruido eléctrico aleatorio. El ruido eléctrico se reduce mediante una jaula Faraday de tipo dos de 40 pulgadas de altura. Los sistemas de control electrónico incluyen una PC equipada con un digitador de datos 1440, una interfaz convertidora de analógico a digital y el software P clamp 10.1.

El amplificador del monitor de la computadora, el manipulador motorizado y un sistema de control de perfusión con enlace de válvula están montados fuera de la jaula de Faraday. En un bastidor eléctrico metálico independiente de 19 pulgadas, todos los equipos eléctricos están conectados a tierra a un distribuidor de cobre y enchufados a un transformador de aislamiento de grado médico, que proporciona aislamiento de línea, una tierra constante y supresión de sobretensiones. Prepárese para los experimentos montando micropipetas con extremos pulidos al fuego y una resistencia de dos a cinco megaohmios en el porta-micropipetas del cabezal.

Las micropipetas de registro se llenan con la solución interna, se golpea suavemente para eliminar las burbujas de aire y finalmente se montan en la etapa de registro. A continuación, utilizando pinzas, transfiera un cubreobjetos con células sembradas a una placa de Petri plástica de 35 milímetros que contenga tres mililitros de solución externa de registro a temperatura ambiente. El volumen de la solución de registro debe medirse con precisión al realizar experimentos con fármacos, durante los cuales se añaden cantidades conocidas de fármaco al recipiente con una micropipeta; coloque luego la placa sobre la platina del microscopio.

Luego, llene la media celda del portaelectrodo micro con cloruro de cesio tres molar. A continuación, inserte el electrodo de referencia en la media celda y coloque el electrodo de tierra en el baño utilizando el micromanipulador, y baje la pipeta de registro al baño de solución. Visualice las células en modo de fluorescencia y centre una célula adherente verde aislada y positivamente transfectada en el centro del campo de visión.

En modo baño, acerque la pipeta de registro hasta situarla muy cerca de la célula. Cero la traza de onda cuadrada observada en la pantalla del ordenador. Ajuste la posición de la pipeta de registro de modo que apenas toque la célula y la traza de corriente cuadrada en la pantalla comience a fluctuar.

Aplique succión suave con una jeringa acoplada hasta formar un sello de gigaohmio. Una vez logrado el sello de gigaohmio, cambie el programa al modo de parche. Aplique un pulso rápido de succión con la jeringa para romper la membrana celular.

Luego cambie al modo de célula y utilice los parámetros de célula completa en el amplificador. Para compensar el transitorio capacitivo, es necesario equilibrar el parche de manera que la solución de registro intracelular se dialice hacia la célula parcheada. Introduzca aquí los protocolos de fijación de voltaje escritos para este experimento.

El experimentador ha diseñado un protocolo para medir corrientes iónicas a través de canales iónicos activados por voltaje que se producen cuando se modula el voltaje a través de la membrana celular. En este caso, estamos analizando un protocolo IV que especifica que el software mantenga la célula a menos 110 milivoltios y luego pase a menos 70 milivoltios durante 250 milisegundos. Luego regresa a menos 110 milivoltios, el potencial de reposo, cada vez que el escalón aumenta en 10 milivoltios, de modo que los pasos sean a menos 70 milivoltios, menos 60 milivoltios, etc., hasta que el último paso sea a más 20 milivoltios.

Filtre las corrientes registradas a 10 kilohercios utilizando un filtro Bessel de paso bajo en el amplificador y digitalice a una frecuencia de muestreo de dos kilohercios usando el software Clamp X 10.1. Utilice únicamente grabaciones con fugas mínimas inferiores al 10 %. Para el análisis, las células HEK 293T se cultivaron y transfectaron con canales de calcio L Cav. Tres canales de calcio como se muestra aquí. La transfección exitosa de ADNc de canales iónicos heterólogos se indicó mediante la fluorescencia generada a partir del vector P-I-R-E-S dos eeg FP.

Aquí mostramos la expresión exitosa de un canal de calcio de voltaje cav tres de invertebrado. Cuando las células no se transfectan, no se pueden inducir corrientes de calcio. En cambio, las células transfectadas generan corrientes grandes cuando se aplican protocolos de bloqueo de voltaje en toda la célula a las células.

Los investigadores pueden utilizar diversas condiciones electrofisiológicas y regímenes de análisis de datos según sus necesidades. Al realizar este procedimiento, es importante recordar que debe usar su propio criterio respecto al momento adecuado para los experimentos. Dado que los diferentes canales se expresan con eficiencias distintas en la membrana celular, depende de usted determinar la estrategia óptima para aumentar la viabilidad de las células y maximizar al mismo tiempo la expresión en la superficie de los canales de interés.

Después de ver este video, esperamos que haya adquirido una buena comprensión de cómo cultivar y mantener una línea celular humana, así como de cómo transfectar ADNc de canales iónicos heterólogos y ADNc de subunidades en estas células. Para la grabación electrofisiológica.