El análisis de las células madre pluripotentes utilizando criosecciones de cuerpos embrioides
8 de diciembre de 2010
Las células madre pluripotenciales de crecimiento en suspensión se diferencian en cuerpos embrioides (EBS). Aquí se demuestra cómo obtener alta calidad cryosections EB útil para el estudio de los aspectos celulares y moleculares de la embriogénesis, mientras que la preservación de su organización en forma de agregados.
Primera parte, Introducción. Hola, me llamo Rafael. Soy investigador posdoctoral en el laboratorio del profesor Stevens Hans en la Universidad Federal de Río de Janeiro, en Brasil.
Hola, me llamo Ismail. Soy ayudante de investigación y también profesor. En este video, mostraremos cómo preparar secciones claras de cuerpos de Android.
Así que comencemos. Parte dos, materiales y equipos. Para este procedimiento, necesitaremos un medio de inclusión para especímenes congelados.
Solución de paraformaldehído al 4 % para la fijación de las células, soluciones de sacarosa para protección crioprotectora. Una aguja con la punta ligeramente doblada, un microscopio estereoscópico para una mejor visualización del EBS y un agitador. Parte tres.
Aquí los cuerpos embrionarios humanos se están cultivando en placas de cultivo no adherentes. Mediante el uso de una pipeta, agrupamos todos los cuerpos embrionarios lo más juntos posible para transferirlos a un tubo cónico de 15 mililitros. Los SBE se recolectan cuidadosamente y se transfieren al tubo.
Es importante recoger todos los EBS, ya que no hay una gran cantidad de material. Después de decantar los EBS, se descarta cuidadosamente el medio de cultivo. Debería poderse ver el precipitado en el fondo del tubo. Ahora podemos proceder con el procedimiento de fijación.
Los EBS se fijarán en una solución de paraformaldehído al 4 % en PBS o solución salina tamponada con fosfato. Es importante resuspender el precipitado con la solución de PFA. A continuación, los EBS se fijan en la solución de fijación durante 30 minutos.
Tras la fijación, se retira cuidadosamente la solución de PFA. Teniendo cuidado de evitar que los EBS se adhieran, se sustituye por una solución de sacarosa al 10% en PBS para iniciar la crioprotección de los EBS, y el material se mantiene en esta solución durante 30 minutos. A continuación, se retira cuidadosamente la solución de sacarosa al 10% y se resuspenden los EBS en una solución de sacarosa al 20%.
Una vez más, los EBS se mantienen durante 30 minutos en esta solución. Finalmente, se elimina la solución de sacarosa al 20% y se sustituye por una solución de sacarosa al 30% en PBS, donde se mantienen durante otros 30 minutos. Ahora podemos proceder a la orientación y bloqueo de los EBS.
En nuestro laboratorio, utilizamos cápsulas vacías como moldes. Para el bloqueo de los EBS, es importante recubrir las paredes internas de la punta con solución de sacarosa antes de recolectar los EBS. Ahora podemos recolectar cuidadosamente los EBS y esperar hasta que se decanten al fondo de la punta.
A continuación, se colocan los EBS en el centro del bloque. Esta debe ser la posición final de los EBS dentro del bloque. Con la ayuda de un microscopio estereoscópico y una punta fina, recolectamos y eliminamos la mayor cantidad posible de solución de sacarosa.
Teniendo siempre cuidado de no recoger los EBS. Utilizando una aguja con la punta ligeramente doblada, todos los EBS se colocan en el centro del bloque. Finalmente, se recoge la solución de sacarosa restante con trozos de papel de filtro.
La ubicación específica del EBS dentro del bloque es muy importante para obtener cortes de buena calidad. A continuación se muestra un ejemplo de una mala colocación del EB dentro del casquete. Tras posicionar el EBS y eliminar la solución de sacarosa, el casquete se llena con OCT comenzando desde los bordes, teniendo siempre cuidado de evitar que el EBS quede suspendido en Resus.
Las burbujas restantes se eliminan utilizando una pipeta, y las cáscaras se agitan durante 15 minutos. Tras la agitación, el bloque de OCT se congela en hielo seco.
En este momento, puede almacenar el bloque envuelto en papel de aluminio a menos 80 grados Celsius para su posterior análisis o proceder al criostato, parte cuatro, corte. Para obtener los cortes criogénicos, necesitará una cuchilla desechable o permanente, OCT y portaobjetos de vidrio tratados con poli-L-lisina. El bloque de OCT se retira del congelador y se mantiene dentro del criostato hasta que alcance menos 20 grados Celsius.
A continuación, el bloque se coloca sobre el soporte y se alinea paralelamente al borde de la cuchilla. Las muestras de EB son mucho más pequeñas que la mayoría de las demás muestras de tejido, por lo que es muy importante asegurarse de que toda la superficie del bloque toque la cuchilla al mismo tiempo, minimizando así la pérdida de material. Después de haber sido posicionado, el bloque se corta en secciones de 10 micrómetros, que se recogen directamente sobre los portaobjetos de vidrio.
Las muestras pueden almacenarse, preferiblemente a menos 70 grados Celsius, o también pueden usarse el mismo día. El material puede teñirse para inmunohistoquímica o inmunofluorescencia. Conclusión. El método descrito aquí proporciona un protocolo razonablemente económico y fácil de seguir para obtener secciones delgadas en criostato de cuerpos embrionarios desarrollados a partir de líneas celulares madre humanas H nine o de ratón US P one.
Las secciones criogénicas resultantes pueden utilizarse en una amplia variedad de procedimientos para analizar la expresión proteica o la morfología del EB.
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Descripción general
Este artículo demuestra el proceso para obtener criosecciones de alta calidad de cuerpos embrionarios (EBs) derivados de células madre pluripotentes cultivadas en suspensión. Estas criosecciones son esenciales para estudiar los aspectos celulares y moleculares de la embriogénesis, manteniendo al mismo tiempo la organización de los EBs.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología de las células madre
- Embriogénesis
- Diferenciación celular
Antecedentes
- Las células madre pluripotentes pueden diferenciarse en varios tipos celulares.
- Los cuerpos embrionoides son agregados que imitan el desarrollo embrionario temprano.
- El estudio de los cuerpos embrionoides ayuda a comprender los mecanismos de la embriogénesis.
- Las criosecciones de alta calidad son cruciales para un análisis detallado.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un método para preparar criosecciones de cuerpos embrioides (EBs).
- Facilitar el estudio de los procesos celulares y moleculares durante la diferenciación.
- Preservar la organización estructural de los EBs en el análisis.
Métodos Utilizados
- Preparación de células madre pluripotentes en cultivo de suspensión.
- Inducción de la diferenciación en cuerpos embrioides.
- Técnicas de microtomía por congelación para obtener muestras de alta calidad.
- Análisis de las características celulares y moleculares de los CE.
Resultados principales
- Preparación exitosa de secciones criostáticas a partir de cuerpos embrioides (EB).
- Conservación de la organización de los cuerpos embrioides (EB) en secciones criostáticas.
- Mejora en la capacidad de estudiar la embriogénesis a nivel celular.
- El método demostrado puede aplicarse a diversos contextos de investigación.
Conclusiones
- El método permite un análisis detallado de los cuerpos embrioides (EBs).
- Las criosecciones de alta calidad son valiosas para estudios embrionarios.
- Este enfoque puede avanzar en la comprensión de la diferenciación de células madre.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El corte criohistológico de alta calidad de cuerpos embrioides (EBs) derivados de células madre pluripotentes permite un análisis espacial preciso de los marcadores de diferenciación y de la organización tisular, apoyando el descubrimiento temprano y la validación de dianas en medicina regenerativa y biología del desarrollo. Esta capacidad aumenta la confianza predictiva en los modelos basados en células madre e informa decisiones ajustadas al riesgo en puntos críticos del proceso de descubrimiento. Secciones criohistológicas confiables de EBs facilitan la integración de datos multidisciplinarios para el avance de carteras de investigación.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la evaluación de la expresión de marcadores de pluripotencia y específicos de linaje dentro de estructuras de cuerpos embrioides tridimensionales.
- Apoya la reducción de riesgos biológicos al aclarar las vías de diferenciación y la heterogeneidad celular.
- Proporciona contexto espacial para la validación funcional de dianas en sistemas derivados de células madre.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Facilita la preparación de cortes criostáticos estandarizados de EB para ensayos reproducibles de inmunofluorescencia e hibridación in situ.
- Permite la evaluación cuantitativa de la distribución de proteínas y ARN a lo largo de las secciones de EB.
- Apoya la escalabilidad del ensayo y la reutilización de la plataforma para cribado de compuestos en modelos de células madre.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Alinea la diferenciación in vitro con los procesos de desarrollo in vivo para la modelización relevante a enfermedades.
- Permite la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la preservación de la arquitectura de los cuerpos embrioides y la localización de marcadores.
- Proporciona conocimientos mecanicistas que orientan las estrategias traslacionales de biomarcadores.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método de criosección se integra en el continuo de descubrimiento, desde los estudios iniciales de diferenciación de células madre hasta el desarrollo de ensayos y la validación de modelos preclínicos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la pluripotencialidad y el compromiso de linaje dentro de los cuerpos embrioides (EB).
- Tamizaje: Proporciona lecturas cuantitativas y reproducibles para la expresión de marcadores y la organización tisular.
- Análisis: Permite mediciones con resolución espacial para el análisis comparativo de condiciones de diferenciación.
- Investigación Traducional: Conecta hallazgos in vitro con relevancia in vivo en el desarrollo, cuando están respaldados por patrones de expresión de marcadores.
- Reutilización Empresarial: Establece un flujo de trabajo estandarizado para el análisis de EB aplicable a múltiples líneas de células madre y protocolos de diferenciación.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la diferenciación de células madre y la validación de objetivos.
- Valor operativo: Estandariza el corte de cuerpos embrioides para análisis posteriores reproducibles.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar datos espaciales y moleculares robustos.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de programas de descubrimiento basados en células madre.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en criosección y manejo de agregados celulares tridimensionales delicados.
- Necesita acceso a criostatos, medios de inclusión e infraestructura de imagen para análisis posteriores.
- Exige la estandarización entre equipos de los protocolos de preparación y seccionado de cuerpos embrioides.
- Adaptable a diversas líneas de células madre pluripotentes y modelos de diferenciación, prestando atención al tamaño y morfología de los cuerpos embrioides.
- Depende de una orientación y inclusión cuidadosas para garantizar secciones de alta calidad e interpretables.
