La criopreservación de tejido cortical Bloques para la generación de cultivos neuronales altamente enriquecido

Hola, mi nombre es Alan y soy del laboratorio del Dr. Horney Lu en la Universidad de California en Irvine, en el Departamento de Neurobiología y Conducta. Y yo soy Bob. Hoy, el Dr. Haro les mostrará un protocolo rápido, eficiente y confiable para la criopreservación rutinaria de bloques de tejido cortical, con el fin de obtener posteriormente cultivos primarios de neuronas de alta calidad.

Así que comencemos. El tejido limpio y troceado se carga en viales criogénicos que contienen un medio de congelación con un 10% de TMSO.

Los viales criogénicos se cargan en un recipiente de congelación y se colocan a menos 80 grados Celsius durante al menos cuatro horas. Luego, los viales criogénicos congelados se colocan en nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo. Para el cultivo, el vial criogénico de AC se derrite en un baño de agua tibia y se enjuaga con HBSS tibio para eliminar el DMSO residual.

Se agrega HBSS fresco junto con tripsina para la disociación, después de lo cual se añade DMM con 10% EBS. Para detener la actividad enzimática disociativa, las células se centrifugan y el sedimento se resuspende en DMM fresco más 10% EBS y se siembran en placas recubiertas previamente con polilisina. Después de 24 horas, el DMM se cambia a un medio neurobasal suplementado y se cultiva durante 10 días.

Este protocolo utiliza una cuchilla de acero para cortar el tejido cortical antes de su uso. La cuchilla debe esterilizarse en etanol al 70 % durante al menos dos horas. Una solución salina tamponada con Hank (HBSS) 1 x se prepara diluyendo una solución concentrada 10 x en agua esterilizada; luego, la solución 1 x HBSS se mantiene en hielo o a cuatro grados Celsius hasta el procesamiento del tejido.

El óxido sulfúrico dimetílico o DMSO se utiliza como crioprotector en el medio de congelación. Este protocolo utiliza una dilución al 10% en volumen de DMSO en H-B-S-S-D-M-S-O 1X, que debe mezclarse completamente antes de almacenarlo a cuatro grados Celsius. Se utiliza un contenedor de congelación Nalgene para controlar la velocidad de congelación de las muestras.

El contenedor de congelación se carga con viales criogénicos de 2,5 mililitros que han sido etiquetados previamente. También es recomendable etiquetar los propios contenedores de congelación si se tiene más de uno y anotar el contenedor correspondiente en la bilis. El medio de congelación con DMSO al 10 %, previamente enfriado, junto con el contenedor de congelación, se introducen en una cabina de seguridad biológica estéril.

Aquí se agrega lentamente un mililitro de medio de congelación a cada uno de los viales criogénicos. Después de asegurarse de que las tapas estén bien sujetas, coloque el recipiente de congelación con los viales a cuatro grados Celsius durante al menos dos horas, justo antes del procesamiento del tejido. La cuchilla de afeitar previamente esterilizada debe enjuagarse completamente. Tres lavados de tres minutos cada uno.

El uso de agua esterilizada debería ser suficiente para eliminar cualquier etanol residual. Este procedimiento de lavado debe ser rápido, ya que la cuchilla es propensa a la oxidación por inmersión prolongada en agua estéril. Antes de la limpieza, el tejido debe colocarse sobre una bolsa de hielo.

Lave ligeramente con una X-H-B-S-S fría para eliminar cualquier residuo suelto. Se utilizan agujas esterilizadas para limpiar los fragmentos de tejido de cualquier membrana o vaso sanguíneo residual. Es necesario tener cuidado para preservar la integridad estructural del tejido durante la limpieza.

Conforme aumente esto, la eficiencia del picado de tejido limpio será visiblemente diferente a la del tejido crudo y debería tener la mayoría de las membranas o vasos sanguíneos eliminados. Una vez que el tejido haya sido limpiado y enjuagado, puede comenzar el picado. Es importante realizar cortes limpios del tejido, creando bloques de aproximadamente un milímetro cúbico de tamaño.

Los bloques que son demasiado grandes producen un rendimiento celular más bajo al descongelarlos. Sin embargo, en los bloques más pequeños también debe evitarse el procesamiento excesivo. Los tejidos picados pueden recolectarse utilizando una pipeta automática y algo de medio H-B-S-S frío al 1X.

Asegúrese de enjuagar el recipiente con HBSS para recuperar todo el tejido recolectado. Luego, el tejido se añade a un volumen grande de HBSS 1X y se deja sedimentar hasta el fondo, formando un precipitado suelto. Esto elimina cualquier resto residual que pueda estar presente mientras el tejido se asienta en el HBSS; recupere el recipiente para congelación previamente enfriado y los viales criogénicos antes de distribuir el tejido.

Asegúrese de destapar todos los viales para acelerar el proceso de llenado del tejido. La exposición al DMSO a temperatura ambiente debe limitarse a no más de 10 minutos. Es recomendable trabajar con un recipiente de congelación a la vez hasta que todo el tejido haya sido utilizado.

Comience a aspirar el sobrenadante de un tejido suelto, acercándose lo más posible al precipitado sin perturbarlo. Luego, coloque una punta de pipeta con orificio ancho de 200 microlitros. No utilice una punta con orificio más pequeño, ya que comprometería la estructura de los bloques que van al fondo del precipitado del bloque de tejido.

Recolecte 200 microlitros de tejido lentamente. Añada este tejido a un vial criogénico y continúe con el siguiente hasta que todos los viales estén llenos. Podría ser necesario aplicar una regla de 10 minutos.

Coloque rápidamente el recipiente de congelación en viales criogénicos dentro de un congelador a menos 80 grados Celsius durante al menos cuatro horas o durante la noche si el tiempo es limitado. Después de un tiempo suficiente, retire el recipiente de congelación del congelador y distribuya los viales criogénicos en una caja criogénica lo más rápidamente posible. Coloque la caja criogénica en un estante de caja de nitrógeno líquido para almacenamiento a largo plazo.

Retire un vial criogénico del nitrógeno líquido lo más rápidamente posible, limitando la exposición de las cajas criogénicas a la temperatura ambiente; derrita rápidamente la muestra sumergiéndola en un baño de agua a 37 grados Celsius. Mantenga siempre la tapa por encima del agua. Revise con frecuencia y continúe el descongelamiento hasta que se observe un pequeño trozo de hielo.

Antes de introducirlo en el gabinete de seguridad, esterilice el vial criogénico con etanol al 70 %. Proceda a añadir el tejido descongelado a un volumen grande de HBSS tibio al 1X si queda tejido en las paredes del vial criogénico. Recójalo suavemente con HBSS.

Una vez que se haya recolectado todo el tejido, invierta el tubo de tres a cuatro veces y deje que el tejido se sedimente en el fondo. Este paso asegura una dilución suficiente del DMSO.

Una vez que el tejido esté asentado, aspire tanto del sobrenadante como sea posible. A continuación, agregue 10 mililitros de H-B-S-S fresco y tibio 1X a este. Añada 300 microlitros de tripsina al 0,25 % y 50 microlitros de DNasas.

Proceda a disociar el tejido con agitación suave, creando una suspensión celular turbia tras la disociación del tejido. Detenga la actividad enzimática añadiendo DMEM caliente más suero bovino enriquecido al 10 %, y centrifugue las suspensiones celulares a 1200 ×g durante cinco minutos. Reuspenda el sedimento celular en DMEM fresco más EBS al 10 % y siembre en placas recubiertas con polilisina.

Deje que las células se adhieran a las placas durante 30 minutos. Luego, reemplace el medio con DM fresco más 10 % de EBS. Después de 24 horas, sustituya el medio que contenía DM por medio neurobasal suplementado con N dos y B 27 y cultive durante 10 días.

Acabamos de detallar un protocolo amplio, eficiente y confiable con una preservación criogénica rutinaria de bloques de tejido cortical. Así que mucha suerte.