Métodos para grabaciones de parche Capacidad de la pinza del cáliz

Hola, mi nombre es Ken Paradiso. Trabajo para Ling Gang Wu en el programa intramural del Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares, que se encuentra en el campus de los NIH en Bethesda. Voy a mostrarles las técnicas para la grabación presináptica en el calículo mediante el método de parche en configuración de sello adherente (patch clamping).

Para preparar el tejido cerebral, extraemos el cerebro de la rata. Colocamos el cerebro dentro de esta solución, que debe estar fría con hielo y con bajo contenido de calcio, y se burbujea con carbógeno para asegurar un suministro constante de oxígeno al cerebro. Además, la solución debe mantenerse fría con hielo para minimizar la DA y reducir al mínimo la cantidad de daño.

Entonces, el cerebro quedaría ahora en esta solución. Lo sacaríamos, lo cortaríamos adecuadamente para que pudiera colocarse sobre el bloque, fijándolo al bloque con Sano correlate o pegamento sintético, pero llenaríamos la cámara con una solución fría con bajo contenido de calcio, la burbujearíamos, la colocaríamos sobre el vibrátomo y luego cortaríamos secciones de 180 a 190 micrones de grosor a una frecuencia de la cuchilla de 70 hercios y una velocidad de avance de 0,01 a 0,02 milímetros por segundo. Es decir, de 10 a 20 micrones por segundo.

Una vez realizada cada sección, transferimos las secciones desde la solución salina fría sobre hielo a esta cámara, que contiene una solución normal de calcio. Esta es la misma solución en la que realizamos la grabación y se encuentra a 37 grados de temperatura fisiológica. Luego colocamos las secciones aquí para su recuperación.

Permanece aquí dentro durante media hora hasta una hora antes de realizar los experimentos de fisiología. Entonces, aquí tengo el cerebro y lo voy a sacar de la solución. Este es un cerebro más grande con fines de demostración.

Esto es de una rata P 20. La daremos la vuelta. Es el bulbo raquídeo en el que estamos interesados.

Entonces, esta zona de aquí abajo y el cáliz tienen sujeción justo en esa área. Lo que vamos a hacer es cortar el resto del cerebro, aislar el bulbo raquídeo y luego preparar el bulbo raquídeo para la cámara de corte. Bien, así que vamos a seccionar el resto del cerebro, aislando únicamente el bulbo raquídeo.

Voy a darle la vuelta para demostrar en dónde estamos. Normalmente no lo haríamos de esta manera, y nuevamente, podemos simplemente eliminar esa parte completa. Dándolo la vuelta nuevamente, hemos aislado el tronco encefálico y vamos a hacer otro corte justo allí.

Vale, eso es todo. Eso es el tronco encefálico. La caliza de Held está justo aquí y allí.

Este es el tronco encefálico. Nuevamente, lo empujaremos un poco hacia atrás. Vamos a cortar un lado del cerebelo y eso permitirá que el tronco encefálico quede de lado así.

Ponemos un poco de pegamento acrílico Sano y, manteniéndolo en posición lateral, lo llenamos rápidamente con hielo frío, solución fría con bajo contenido de calcio. Introducimos la línea de oxígeno lo antes posible. Ahora lo tomamos y lo llevamos al vibrátomo.

Lo introducimos rápidamente para llegar al inicio del cerebro, y luego, una vez que alcanzamos el inicio del cerebro, reducimos la velocidad a 0,01 milímetros por segundo. Es decir, 10 micros por segundo. Por lo tanto, se mueve a una velocidad increíblemente lenta.

La primera porción del cerebro es la parte que tiene el mtb, que es el núcleo medial del cuerpo trapezoide. Y esa es la parte que contiene la, está bien, entonces una vez que lo tengo en la pipeta de transferencia, trato de acercarlo lo más posible a la punta de la pipeta. Y ahí está la sección del cerebro y la transfiero bastante rápido a esta cámara, que contiene una solución de registro estándar con niveles normales de calcio y también una temperatura más elevada.

Y eso permitirá que las secciones se recuperen tras los procedimientos de corte, para que estén listas para experimentos de fisiología. Bien, a partir de aquí, será lo mismo una y otra vez. El siguiente equipo es el que utilizaré para realizar el parcheo.

Tenemos un microscopio vertical con platina fija. La platina es fija, como dije, de modo que el microscopio se mueve debajo de ella mediante un manipulador. Utilizamos un manipulador micrométrico Wigs y Newman para sostener la platina, así como la etapa principal del amplificador; usamos un amplificador de parche de lazo EPC 10 de HECA.

Y lo que también debería haber mencionado es que utilizamos DIC con luz infrarroja. Por lo tanto, tenemos una cámara IR aquí, y todo lo que veamos aparecerá en la pantalla cuando estemos buscando CAEs. El amplificador de registro por parche está controlado por este software, llamado Pulse, que también proviene de Heca, y que controlará el amplificador y todo el experimento de fisiología.

Los resultados aparecerán en esta pantalla. El caly que se ha conservado es un terminal presináptico grande, y debido a su tamaño, nos permite hacer una conexión física al terminal. Así podemos obtener grabaciones presinápticas, lo cual es algo único, especialmente en el SNC.

Esto nos permite medir los canales de calcio activados de forma presináptica. Además, también podemos medir la actividad del potencial de acción si deseamos estimular el nervio que conduce a la caliza. Lo que hacemos en este laboratorio es medir un proceso denominado exocitosis, que es la fusión de vesículas que contienen neurotransmisores con la membrana.

Ahora, cuando esas vesículas se fusionan con la membrana en un proceso denominado exocitosis, añaden membrana al terminal sináptico, y podemos medirlo como un cambio en la capacitancia. Obtendremos un aumento en la capacitancia a medida que se añade membrana al terminal, de modo que los experimentos que mostraré hoy son mediciones de capacitancia realizadas de forma presináptica cuando la membrana es eliminada. Por lo tanto, no se puede seguir añadiendo membrana indefinidamente; por supuesto, hay que eliminar algo.

Ese proceso se denomina endocitosis o captación de membrana. También podemos medirlo, y se medirá como una disminución en el nivel de capacitancia, y mostraremos ejemplos de esto más adelante. Ahora bien, esto nos permite monitorear la actividad de los canales de calcio y también observar algunas de las proteínas que participan en la exocitosis y la endocitosis y estudiarlas.

Podemos introducir sustancias como péptidos para bloquear proteínas que participan en la exo o endocitosis. También podemos usar toxinas que producen el mismo efecto. Además, podemos ajustar las cantidades de calcio que entran en el terminal, de modo que podemos estudiar realmente el proceso de exocitosis, la liberación del neurotransmisor, así como la captación de la membrana que sigue a ese evento.

Este es el tubo que contiene nuestra solución de registro intracelular. La preparamos con antelación y luego la congelamos; por lo general, se puede utilizar durante varias semanas hasta un mes antes de tener que preparar una solución nueva. Nuevamente, pensamos en ello inmediatamente antes de realizar nuestros registros, y siempre se obtiene una cierta cantidad de partículas de polvo u otro tipo de residuos que pueden entrar en el tubo.

Puede hacer una de dos cosas. Puede retirar la solución y filtrarla, o puede centrifugarla durante uno o dos minutos y luego extraer la solución, dejando una porción inferior que contendría residuos y otros materiales. Por lo tanto, prefiero centrifugarla y lo haré ahora mismo.

Entonces, este es el tubo que contiene nuestra solución intracelular. Está descongelado. Vamos a centrifugarlo durante aproximadamente dos o tres minutos en una pequeña centrífuga, lo cual debería ser suficiente para eliminar cualquier partícula grande de polvo de la solución.

Ahora retiro simplemente la parte superior, la solución que acabamos de centrifugar, teniendo cuidado de no agitarla, y la transfiero a un tubo limpio; retiro aproximadamente el 90 % de ella. Intento nuevamente no tomar ese último poco. Así que me detendré justo aquí.

Esto lo puse inmediatamente en hielo para que permanezca frío durante el experimento. Eso es muy importante. Esta es, esta es una de nuestras pipetas.

Utilizamos esto para grabaciones intracelulares. Es un vidrio de sílice de pared gruesa, con un diámetro externo de dos milímetros y un diámetro interno de 1,16 milímetros. Primero, lo que hacemos es rellenar la pipeta desde atrás.

Así que aplicamos succión, colocamos la pipeta en la solución de registro y aplicamos succión para intentar llenar la punta muy, muy fina de la pipeta, ya que de otro modo no se llenaría de ninguna manera. Una vez hecho esto, tomamos un tubo capilar y llenamos el resto del electrodo introduciendo el líquido por la parte trasera de la pipeta. Esta es una técnica estándar en fisiología que consiste literalmente en dar un golpe seco.

Corre el riesgo de romper la punta de la pipeta, pero también tendrá, si no lo hace, con frecuencia burbujas de aire. Bien, ahora la colocamos en el porta-pipetas, que está conectado al cabezal del amplificador de registro de parches. Allí hay un alambre de cloruro de plata.

El alambre de cloruro de plata entra en contacto con la solución intracelular, y eso nos permite medir la actividad eléctrica en el terminal presináptico. Entonces, lo que hacemos es encontrar el corte que tenga muchos CAEs. Queremos una alta densidad de CAEs.

Entonces, estamos buscando el núcleo medial del cuerpo trapezoide, que es el MNTB, y allí es donde se encuentra el terminal, que forma el calix sostenido, o sea, el calix app. Por lo tanto, lo que hacemos es comenzar a escanear a través del corte. Por ejemplo, allí tenemos un calix que está un poco profundo respecto a la superficie y no hay mucho para hacer el parche, así que simplemente continuamos escaneando a lo largo del corte.

Entonces, esto es un cáliz aquí al que vamos a apuntar. He hecho dos marcas en la pantalla, que indican dónde va a colocarse la pipeta. Y pueden ver que hay un fragmento de cáliz hacia el que avanzará la pipeta; esta va a descender.

Voy a aplicar presión positiva para que empuje hacia arriba contra la caliza, y luego voy a liberar la presión positiva. Entonces, la caliza va a empujar hacia arriba contra la pipeta, y en ese momento aplico una succión muy suave e intento succionar y empujar la membrana o lograr que la membrana se selle en la punta de la pipeta. Muy bien, liberada la presión positiva.

Y ahora voy a aplicar succión. Entonces, aquí estamos aplicando un pulso de cinco milivoltios, o en realidad un pulso de cuatro milivoltios. Muy bien, eso es todo. Muy bien.

Ahora bajamos el potencial de membrana a menos 80 y cancelamos el pico transitorio rápido. Ahora vamos a modo de célula entera. Voy a aplicar succión suave e intentaré pasar a modo de célula entera.

Esos transitorios de carga indican que él, que la pipeta y la célula ahora están continuas, que ha obtenido una grabación estable. Esa es otra imagen excelente. Entonces, el rojo más claro corresponde al trazo de la capacitancia, y se puede observar un salto repentino y luego una disminución.

Vale, acabo de mostrarle las técnicas básicas para obtener grabaciones de un terminal presináptico de calizo sostenido. Le he mostrado cómo producir cortes que contengan el núcleo medial del cuerpo trapezoide. Allí es donde encontrará los calizos sostenidos.

Y le he mostrado las técnicas para examinar las secciones. Deberá revisar cada una de las secciones, buscando aquella que tenga el mayor número de caly en la superficie. Luego, deberá buscar la membrana de caly más grande que encuentre y realizar un registro mediante parche de membrana en ella.

Y también le he mostrado las técnicas de registro de parche, y esas son técnicas estándar de registro de parche.