Grabaciones postsinápticos en las dendritas aferentes cocleares ponerse en contacto con las células ciliadas internas: Comunicado de Vigilancia multivesiculares en una sinapsis cinta

El objetivo general de este procedimiento es registrar la actividad postsináptica en las sinapsis aferentes de las células ciliadas internas. Esto se logra primero exponiendo el epitelio sensorial de una cóclea recién extraída de una rata decapitada. El segundo paso del procedimiento consiste en posicionar el giro apical extirpado sobre un cubreobjetos modificado y transferirlo a la cámara de registro.

El tercer paso del procedimiento consiste en localizar y acceder a una fibra aferente con un electrodo de registro. El paso final del procedimiento es formar un sello hermético sobre la membrana de la fibra aferente y luego romperla, estableciendo así la configuración de célula completa de la técnica de registro de parche. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren la ocurrencia o potenciales postsinápticos provenientes de una única sinapsis en cinta mediante la electrofisiología de registro de parche en configuración de célula completa.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que la disección y preparación del tejido coclear es difícil de aprender y las fibras aferentes pequeñas son difíciles de reconocer y acceder. Antes de comenzar la disección, prepare un cubreobjetos modificado que mantendrá la preparación en su lugar durante las grabaciones. Utilizando un cubreobjetos circular de vidrio de ocho a doce milímetros, aplique una gota de Sylgard semicurado cerca del borde del cubreobjetos.

Coloque el extremo grueso de un alfiler fino para insectos sobre el cubreobjetos. Sujete firmemente el alfiler contra el vidrio. Con pinzas, caliente el borde protector contra una bobina caliente para fijarlo.

Prepare de 10 a 20 microelectrodos según se describe en el texto adjunto. Después de pulir mediante llama con una microherramienta, el microelectrodo debe tener un diámetro externo de la punta de aproximadamente un micrón. El grosor final de la pared de la pipeta equivale a aproximadamente un tercio de micrómetro tras la anestesia y la decapitación de una rata de tres semanas de edad.

Comience la disección retirando la piel mediante la disección de la cabeza y la extracción del cerebro. Para exponer el hueso temporal, retire ambos huesos temporales. Coloque cada hueso temporal en un recipiente de disección limpio que contenga solución extracelular estándar. El siguiente paso consiste en eliminar el hueso que encapsula el hueso temporal, con el fin de exponer la cóclea.

Sujete firmemente el hueso temporal por la base con un par de pinzas. Identifique la ventana redonda y la ventana oval y la cóclea. Oriente la cóclea de modo que la ventana oval y el lado espiral de la cóclea queden orientados hacia arriba.

Elimine el exceso de hueso alrededor de la cóclea. Utilice un segundo par de pinzas finas para desmenuzar el hueso directamente de la cóclea, comenzando por la zona que es más transparente que el resto del hueso. En esta región, el hueso es más delgado y más fácil de remover.

Continúe retirando el hueso alrededor de la espira apical. Utilice tijeras microquirúrgicas para cortar a través del médium bajo la vuelta apical. Luego, desconecte la vuelta apical de las vueltas inferiores de la cóclea.

Tenga cuidado de proteger la espira apical. No debe ser jalada ni estirada. Finalmente, retire la vuelta apical de la cóclea sin desgarrar demasiado el tejido.

Utilice fórceps finos para retirar el resto del hueso. El siguiente paso es retirar el STR de oculis y la membrana tial. Retire cuidadosamente el STR de oculis, la tira brillante de tejido situada fuera de la región de las células pilosas.

Asegúrese de evitar retirar las células ciliadas sensoriales, que pueden desprenderse fácilmente junto con el STR de oculis. A continuación, use pinzas finas para separar la membrana tial. La membrana brillante y semitransparente que se encuentra sobre las células ciliadas sensoriales; ahora recorte el exceso de tejido y hueso, y aplane la preparación con las pinzas.

Esto es necesario para que el tejido pueda colocarse uniformemente debajo de un alfiler. La disección ha finalizado. Coloque el preparado bajo el alfiler sobre el portaobjetos preparado, teniendo cuidado de posicionar el alfiler lejos de las células pilosas una vez completada la disección.

Utilice pinzas para transferir la preparación a la cámara de registro, manteniendo una gota de líquido extracelular sobre el cubreobjetos que sostiene el tejido coclear, e inmediatamente comience la perfusión con solución extracelular. Para asegurar una mejor supervivencia de la preparación, utilice el objetivo de 10 x del microscopio o el objetivo DIC de inmersión en agua de 40 x. Para localizar la preparación, oriente esta de manera que los electrodos de registro puedan aproximarse a las células ciliadas internas en ángulo recto respecto a sus paredes laterales.

Si la visibilidad de la región basal de las células pilosas internas es limitada porque la preparación está enrollada, utilice un electrodo de registro para empujar el borde externo de la preparación contra la cubierta de vidrio, teniendo cuidado de evitar presionar directamente las células pilosas internas. En esta preparación, el electrodo superior mantiene sujeto el borde externo de la preparación, mientras que el electrodo inferior marca la ubicación de los bastones aferentes.

Como referencia, la cámara NC 70 Nuv Con muestra en el monitor la imagen aumentada de Forex para evaluar si el tejido en la región de las células ciliadas internas está sano. Localice los cinetes ciliares como punto de referencia y enfoque hacia abajo para encontrar los núcleos. Enfoque más profundamente hacia la base de las células ciliadas internas con sus terminaciones aferentes y luego regrese hacia arriba hasta alcanzar el nivel de los núcleos en el monitor.

Ahora localice los bastones aferentes alrededor de la base de las células pilosas internas. Los bastones son esféricos u ovalados, tienen aproximadamente un micrón de diámetro y son de color claro con apariencia brillante. Los encontrará enfocando hacia arriba y hacia abajo.

El siguiente paso consiste en despejar un camino hacia las fibras aferentes utilizando un electrodo de registro con una punta de un micrón rellena con solución intracelular. Aplique presión positiva y utilice el micromanipulador para mover el electrodo hacia la preparación. Use este electrodo para realizar una incisión en la preparación a nivel de la base de las células ciliadas internas.

Empuje el electrodo entre la capa delgada de células de sostén y las células ciliadas internas utilizando presión positiva para crear una vía de acceso hasta la zona en la base de las células ciliadas internas. Retire cuidadosamente el electrodo y sustitúyalo por un electrodo nuevo con una punta de un micrómetro de diámetro, lleno de solución intracelular. Utilizando presión positiva para mantener la punta del electrodo limpia, mueva el electrodo de registro a través del orificio de acceso, rodeando las células de sostén adyacentes, hacia el bastón aferente.

Asegúrese de que la punta del electrodo esté directamente frente al batón aferente. Los batones ofrecen más resistencia al movimiento de la pipeta que las células de sostén y la membrana de la célula ciliar interna. Esta diferencia puede percibirse al mover la pipeta; mueva la pipeta hacia arriba y hacia abajo y empuje para verificar que el batón se desplace. Esto indica que la punta de la pipeta y el batón están en el mismo plano de enfoque, con el electrodo presionado contra el batón aferente. Simultáneamente, libere la presión positiva y aplique succión para formar un sello de gigaohmios.

Aplique ráfagas suaves de succión para romper la membrana dentro del electrodo y obtener un registro de célula íntegra. Si la célula emparchada es un bastón aferente, se observan transitorios capacitivos pequeños en el modo de registro de célula íntegra. Esta figura muestra un transitorio típico registrado de una fibra aferente.

Comience a registrar la actividad sináptica. Si la fibra aferente no exhibe actividad espontánea, despolarice la célula pilosa aplicando una solución extracelular con una concentración más alta de potasio. Esta figura muestra las relaciones típicas entre corriente y voltaje para las fibras AFF a la izquierda y las células pilosas internas a la derecha.

Se registraron las relaciones corriente-voltaje a un potencial de reposo de menos 84 milivoltios con escalones de voltaje desde menos 124 milivoltios hasta más 36 milivoltios en incrementos de 10 milivoltios. Los voltajes se muestran a la derecha de algunos trazos, centrándose en las relaciones corriente-voltaje de una fibra aferente. Obsérvese que los potenciales postsinápticos excitatorios o EPC están presentes durante la mayor parte de los escalones de voltaje.

Las CEP invirtieron un potencial positivo de aproximadamente seis milivoltios positivos. Esta grabación se realizó en presencia de tetraetoxina para bloquear las corrientes de sodio dependientes del voltaje; sin el bloqueador, habrían aparecido adicionalmente corrientes entrantes de sodio de activación rápida en la grabación e identificado el registro como proveniente de una fibra aferente. Obsérvese la corriente entrante de activación lenta a voltajes hiperpolarizantes.

Esta corriente no está presente en las células ciliadas internas ni en las células de sostén y proporciona una buena indicación de que la grabación proviene de una fibra aferente. Estas grabaciones muestran las relaciones corriente-voltaje de una célula ciliada interna. La flecha señala las corrientes de potasio salientes de activación rápida a potenciales positivos.

Estos están seguidos por corrientes de potasio rectificadoras tardías debido a un diámetro estrecho de la pipeta y una alta resistencia de acceso. Las corrientes de las células ciliadas internas mostradas aquí son más pequeñas de lo esperado para obtener grabaciones precisas de las corrientes de las células ciliadas internas. Se deben utilizar pipetas con resistencias de acceso más bajas.

Sin embargo, las grabaciones presentadas aquí demuestran que las relaciones corriente-voltaje de las células ciliadas internas y las fibras aferentes pueden distinguirse claramente. Esta figura muestra corrientes sinápticas registradas de una fibra aferente. Observe el tamaño y la forma variables de los PCE.

Las grabaciones se realizaron a temperatura ambiente con tetraetoxibencilona aplicada para bloquear las corrientes de sodio dependientes del voltaje. Esta figura muestra grabaciones simultáneas de una célula ciliar interna y un bastón aferente en contacto. Se utilizó un escalón de voltaje para despolarizar la célula ciliar interna y, como respuesta, se registraron corrientes de calcio entrantes; la entrada de calcio en la célula ciliar interna provoca la liberación de neurotransmisores y activa las corrientes postsinápticas excitadoras en el bastón aferente.

Téngase en cuenta que la depresión sináptica que aparece durante una despolarización de 50 milisegundos de la célula ciliar interna mientras se realiza este procedimiento. Es importante recordar tener cuidado al diseccionar y preparar el tejido coclear, y mantener la paciencia y optimismo al intentar registrar de los terminales aferentes.