Aislamiento mitocondrial del músculo esquelético
30 de marzo de 2011
Este protocolo describe un procedimiento para estudiar la respiración de las mitocondrias aisladas de los músculos esqueléticos. Este método fue adaptado de Scorrano Et al. (2007). El procedimiento de aislamiento mitocondrial requiere aproximadamente 2 horas. La respiración mitocondrial se puede completar en aproximadamente 1 hora.
El objetivo general de este procedimiento es aislar mitocondrias y realizar la respiración mitocondrial. Esto se logra primero aislado músculo esquelético de ratas spray dly. A continuación, el músculo se homogeniza y las mitocondrias se aíslan mediante centrifugación.
La concentración de proteína se determina entonces utilizando el ensayo de Bradford. Finalmente, la respiración mitocondrial se mide mediante poligrafía. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran el consumo de oxígeno a través de los diferentes estados de la respiración mitocondrial.
Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del músculo esquelético, como el efecto de diferentes intervenciones sobre la función mitocondrial. Aunque este método puede proporcionar información sobre el metabolismo del músculo esquelético, también puede aplicarse a otros órganos como el hígado, el cerebro, el riñón o casi cualquier tejido antes de comenzar el procedimiento. Para aislar el músculo esquelético, prepare las siguientes soluciones: P-B-S-P-B-S más 10 milimolares de EDTA, ocho veces tampón de aislamiento mitocondrial, tampón de aislamiento uno o IB uno, tampón de aislamiento dos o IB dos y tampón experimental o eb.
Vea el protocolo escrito adjunto para obtener instrucciones. A continuación, encienda la centrífuga y ajústela a cuatro grados Celsius. Encienda un baño de agua y ajústelo a 37 grados Celsius.
En un recipiente adecuado, coloque tres vasos de precipitados de 10 mililitros, un homogenizador Potter-Elvehjem, molinillos de tejido para gemelos, tijeras quirúrgicas pequeñas y 10 tubos microcentrífuga sobre hielo. Todo debe mantenerse frío con hielo durante todo el experimento. Coloque el IB uno y el IB dos en HIELO y el EB en un baño de agua tibia.
Luego, agregue las siguientes soluciones a los tres vasos de precipitados sobre hielo: vaso uno, 10 mililitros de PBS; vaso dos, 10 mililitros de P-B-S-E-D-T-A; vaso tres, tres mililitros de ib. Uno, eutanice una rata según los procedimientos aprobados por el comité local institucional de cuidado y uso de animales de laboratorio.
A continuación, aísle rápidamente de 250 a 500 miligramos de músculo esquelético con pinzas y tijeras Mayo Clinic. Enjuáguelo en el vaso uno, luego transfiéralo al vaso dos, para homogenizar el músculo. Primero, transfiéralo al vaso tres, y finalmente córtelo en trozos pequeños con tijeras.
Transfiera la solución al homogenizador Potter-Elvehjem y homogenice el músculo utilizando un pistilo motorizado 10 veces, manteniendo el tubo siempre en hielo. A continuación, transfiera el homogenato a tubos preenfriados de microcentrífuga de dos mililitros y centrifugue a 700 ×g durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Transfiera el sobrenadante S a un nuevo tubo de microcentrífuga previamente llenado y deseche el precipitado de la centrifugación.
El sobrenadante S a 10 500 G durante 10 minutos a cuatro grados Celsius, transfiera el SNAT a un nuevo tubo microcentrífugo previamente llenado y etiquételo como SN uno y tipo de músculo Reese. Suspenda el precipitado en 500 microlitros de IB dos, luego centrifugue a 10 500 G durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo microcentrífugo previamente llenado y etiquételo como SN dos y tipo de músculo.
Suspenda el pellet mitocondrial final en 100 microlitros de IB dos. Centrifúguelo en una minicentrífuga durante unos segundos. Si hay un pellet, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo microcentrífugo previamente lleno y deseche el pellet. La calibración del electrodo de oxígeno es un paso clave en este protocolo y debe realizarse diariamente.
La calibración del electrodo puede completarse durante el aislamiento mitocondrial. Para comenzar, agregue 100 mililitros de agua destilada a un matraz de 250 mililitros y agite vigorosamente durante 20 minutos. Para equilibrar el agua con el gas atmosférico, cubra el electrodo GRAT con unas gotas de cloruro de potasio al 50%.
A continuación, coloque un pequeño trozo de papel para liar azul Rizla encima del electrodo. Luego, coloque un trozo de membrana de PTFE encima del papel para liar.
Aplique el anillo interno utilizando el aplicador de anillos y luego coloque el anillo externo en la ranura del electrodo. Conecte los electrodos y ensamble la base del anillo de plástico más grande, la cámara mitocondrial y las mangueras de agua. Encienda las cajas GRAT e inicie el software GRAS.
Agregue el agua equilibrada a la cámara mitocondrial. Luego agregue una barra de agitación para encender la barra de agitación. Haga clic en hardware.
Luego agite a una velocidad. Ajuste la velocidad a 60 y haga clic en iniciar. A continuación, comience un nuevo experimento.
Haga clic en calibrar y luego en calibración de fase líquida. Para el cuadro uno, cambie la temperatura a 37 grados Celsius y haga clic dos veces en aceptar. Cuando la anulación cambie a aceptado, haga clic en ella y abra el tanque de gas nitrógeno.
Coloque la punta conectada al tanque de nitrógeno dentro de la cámara y establezca oxígeno cero. Haga clic en aceptar cuando cambie de sobrescritura. Aspire el agua y agregue 500 microlitros de EB a las cámaras mitocondriales.
Cierre la cámara con un émbolo. Si utiliza varias cajas, repita desde el paso de calibración para cada caja. Inicie un nuevo experimento y déjelo correr aproximadamente un minuto.
Para estabilizar la señal, agregue el volumen necesario de la suspensión de mitocondrias para obtener 150 microgramos en cada cámara. Marque el evento y deje que continúe durante un minuto. Añada 10 microlitros de glutamato 250 milimolar y malato 125 milimolar tibios para alcanzar una concentración final de glutamato 5 milimolar y malato 2,5 milimolar, marque el evento y deje que continúe durante un minuto.
Esto se define como estado dos. A continuación, agregue 7,5 µL de ADP 10 mM para obtener una concentración final de 150 µM. Luego marque y deje correr durante 30 segundos.
Esto se define como estado tres. Añada otros 7,5 microlitros de DP 10 milimolar marcado, y deje correr durante 1,5 minutos. Añada 0,5 microlitros de oligomicina fría 10 milimolar para una concentración final de un micromolar marcado, y deje correr durante tres minutos.
Esto se define como estado cuatro. Añada un microlitro de FCCP frío, 0,1 milimolar, para obtener una concentración final de 0,2 micromolar, y deje RUM durante tres minutos. Esto se define como estado cinco.
Una vez finalizado, termine el experimento y guárdelo. Adquiera las tasas de respiración utilizando el software raft. Ingrese el factor de normalización.
Si se agregan 150 microgramos de proteína mitocondrial, el factor de normalización será 0,15. Calcule las tasas de respiración normalizadas para los diferentes estados respiratorios. Calcule la relación de control respiratorio o RCR dividiendo el estado tres entre el estado cuatro.
Esta figura muestra un trazado representativo del consumo de oxígeno por el músculo esquelético. Mitocondrias. Una vez que la señal del electrodo se estabiliza, la muestra de mitocondrias se añade a la cámara GRAT. La respiración en el estado dos comienza con la adición de glutamato y malato.
La adición de ADP aumenta el consumo de oxígeno. Definición del estado tres. La respiración con síntesis de ATP se bloquea mediante la adición de oligomicina para obtener la respiración en estado cuatro.
Finalmente, se añade FCCP para desacoplar la respiración mitocondrial. Este diagrama muestra tasas representativas de consumo de oxígeno para los estados 2, 3, 4 y cinco. La razón de control respiratorio o RCR se calcula para cada experimento.
Un RCR mayor que cuatro se considera evidencia de una preparación de mitocondrias viable. Durante la realización de este procedimiento, es importante mantener las muestras mitocondriales en hielo en todo momento. Después de seguir este procedimiento.
Se pueden realizar otros métodos, como las transferencias Western, para responder preguntas adicionales, como el contenido de proteínas mitocondriales. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo aislar mitocondrias del músculo esquelético, así como de la respiración mitocondrial.
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Descripción general
Este protocolo describe un procedimiento para aislar mitocondrias de músculos esqueléticos y medir su respiración. El método permite la evaluación de la función mitocondrial mediante el análisis del consumo de oxígeno.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Metabolismo
Antecedentes
- Las mitocondrias desempeñan un papel crucial en la producción de energía.
- Comprender la respiración mitocondrial es esencial para estudiar los trastornos metabólicos.
- Este protocolo se adapta a metodologías establecidas.
- El aislamiento de mitocondrias es fundamental para la medición precisa de su función.
Objetivo del estudio
- Aislar mitocondrias de tejido muscular esquelético.
- Medir las tasas de respiración mitocondrial.
- Analizar el consumo de oxígeno en diferentes estados de la respiración mitocondrial.
Métodos Utilizados
- Aislamiento de músculo esquelético de ratas sometidas a secado por aspersión.
- Homogeneización del tejido muscular.
- Centrifugación para aislar mitocondrias.
- Determinación de la concentración de proteína mediante el ensayo de Bradford.
- Medición de la respiración mitocondrial utilizando poligrafía.
Resultados principales
- Aislamiento exitoso de mitocondrias del músculo esquelético.
- Evaluación cuantitativa de la respiración mitocondrial.
- Los resultados indican un consumo de oxígeno variable en diferentes estados respiratorios.
Conclusiones
- El protocolo aísla eficazmente mitocondrias para estudios de respiración.
- Los hallazgos contribuyen a comprender la función mitocondrial en los procesos metabólicos.
- Este método puede aplicarse a investigaciones adicionales sobre el metabolismo muscular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Aislar mitocondrias funcionales del músculo esquelético permite reducir el riesgo mecanicista de los objetivos metabólicos en el descubrimiento preclínico. Las mediciones cuantitativas de la respiración proporcionan confianza predictiva para la validación de objetivos y el análisis de vías metabólicas. Este método apoya decisiones tempranas de avance o interrupción del desarrollo al establecer umbrales de viabilidad mitocondrial antes del cribado de compuestos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Interroga hipótesis terapéuticas mediante la vinculación de la función mitocondrial con el metabolismo del músculo esquelético y la homeostasis energética.
- Valor operativo: Permite la desestimación biológica mediante el aislamiento estandarizado de mitocondrias viables con una relación de control respiratorio (RCR) ≥4 como referencia funcional.
- Valor predictivo: Apoya la selección de carteras al cuantificar las relaciones de control respiratorio que reflejan la integridad mitocondrial y la eficiencia de acoplamiento.
Desarrollo de Pruebas y Selección
- Valor científico: Prepara sistemas mitocondriales validados para ensayos bioquímicos y funcionales posteriores, incluyendo actividad enzimática y proteómica.
- Valor operativo: Asegura la estandarización de ensayos mediante la calibración diaria del electrodo de oxígeno y la normalización consistente de proteínas utilizando el ensayo de Bradford.
- Valor de escalabilidad: Permite la evaluación confiable de compuestos mediante mediciones reproductibles de la respiración en los estados 2-5 bajo condiciones controladas de sustrato e inhibidor.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la relevancia de la enfermedad al estudiar la respiración mitocondrial en el músculo esquelético, un tejido clave en los trastornos metabólicos.
- Valor operativo: Proporciona continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante la medición cuantitativa del consumo de oxígeno en diferentes estados respiratorios.
- Avance ajustado al riesgo: Orienta las decisiones al medir la respiración desacoplada (estado 5) y la ligada a ATP (estado 3) para evaluar la salud bioenergética.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la prueba de hipótesis hasta la identificación de compuestos prometedores, apoyando programas dirigidos a las mitocondrias en enfermedades metabólicas.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis mediante el aislamiento de mitocondrias para esclarecer las vías implicadas en la síntesis de ATP y la señalización metabólica.
- Tamizaje: Permite la preparación de ensayos mediante mediciones reproductibles de la respiración que facilitan la comparación de los efectos de compuestos sobre el consumo de oxígeno.
- Análisis: Genera lecturas cuantitativas (respiración en los estados 2-5, RCR) que ayudan a los equipos a comparar condiciones y evaluar la función mitocondrial.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica al proporcionar datos funcionales de mitocondrias relevantes para modelos de metabolismo muscular y gasto energético.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable de aislamiento y respiración aplicable a diversos tipos de músculo esquelético y adaptable a otros tejidos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en la viabilidad mitocondrial, reducción de la ambigüedad mecanicista en estudios del metabolismo energético.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad de los ensayos de aislamiento mitocondrial y respiración.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas en programas de dianas metabólicas.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, basadas en ratios de control respiratorio y perfiles de respiración específicos por sustrato.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de aislamiento mitocondrial, centrifugación y medición de la respiración.
- Depende de instrumentación que incluye homogeneizadores, centrífugas mantenidas a 4°C, baños de agua a 37°C y sistemas con electrodo polarográfico de oxígeno.
- Necesita la estandarización entre equipos del preparado de tampones, la calibración diaria del electrodo y el manejo estricto de las muestras bajo condiciones de hielo.
- Las consideraciones para la adaptación incluyen el ajuste de la cantidad de músculo (250-500 mg) y de la carga de proteína mitocondrial (150 µg) según el tipo de músculo esquelético.
- Las limitaciones prácticas incluyen la necesidad de reactivos frescos, una ventana corta para el estudio funcional (~1 h después del aislamiento) y la calibración diaria de los electrodos de oxígeno.
