El uso de un flujo de goteo y la rotación del disco para reactores Staphylococcus aureus Análisis de Biofilm

El objetivo general de este procedimiento es cultivar biopelículas bacterianas bajo fuerza de cizallamiento baja o moderada, utilizando ya sea un reactor de flujo por goteo o un reactor de disco rotatorio. Las placas en los reactores de biopelícula se inoculan primero con bacterias y se incuban a 37 grados Celsius para permitir que las células bacterianas se adhieran a las superficies de crecimiento. Una vez que las células se han adherido a las placas, se inicia un flujo de medio de crecimiento que genera una fuerza de cizallamiento que actúa durante el desarrollo de la biopelícula.

Los biofilms maduros pueden entonces cosecharse para su análisis y observación. Puede realizarse microscopía electrónica de barrido para determinar la estructura ultrafina de los biofilms producidos. Soy Blaze Balls.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como las celdas de flujo es que se logra fácilmente una alta producción de biomasa y múltiples biofilms idénticos. La demostración de este procedimiento estará a cargo de Rachel Stevenson y Kelly Schwartz, una técnica y una estudiante de posgrado de mi laboratorio. El reactor de biofilm de flujo por goteo consta de cuatro cámaras con puertos de entrada para el medio y puertos de salida para la eliminación de desechos.

Dentro de cada cámara hay un portaobjetos desmontable sobre el cual crece el biofilm. Para armar el reactor de biofilm de flujo por goteo, coloque los portaobjetos en cada cámara paralela y asegure las tapas de las cámaras. Autoclave el reactor armado, así como el tubo de nutriente de entrada, para esterilizar el sistema antes de su uso.

También esterilice en autoclave el medio de crecimiento para biopelículas para inocular el reactor de flujo por goteo esterilizado. Coloque el aparato sobre una superficie plana y sujete las líneas de efluente. A continuación, llene cada cámara con 10 mililitros de medio de crecimiento estéril a base de caldo de soya tripticasa, y agregue 100 microlitros de staphylococcus aureus.

Cultivo nocturno crecido en el mismo medio para cada cámara por separado. Coloque el reactor inoculado en un incubador a 37 grados Celsius durante 18 horas para permitir que las células se adhieran a la superficie del disco. Después de la incubación, sujete con pinza UNC el tubo de efluente y coloque el reactor sobre un bloque de madera inclinado a un ángulo de 10 grados. Asepticamente.

Conecte el tubo de nutriente fluido a una botella que contenga caldo nutriente de flujo continuo. Pase la línea del tubo a través de la bomba y cebre el tubo haciendo funcionar la bomba a máxima velocidad. Una vez que el tubo fluido esté cebado, detenga la bomba y coloque agujas de calibre 22 de una pulgada en el extremo de cada tubo.

Limpie el tapón de entrada de la cámara con una toallita de etanol de forma aséptica. Inserte las agujas a través del tapón de entrada. Encienda la bomba y permita que el medio gotee sobre los discos.

Con un caudal de aproximadamente 125 microlitros por minuto, el medio debe fluir hacia abajo desde el puerto del tapón de entrada hasta el puerto de efluente. Haga funcionar el reactor en flujo continuo durante tres días. Compruebe ocasionalmente que el reactor tenga un drenaje adecuado.

El drenaje se verifica mediante inspección visual de las cámaras para asegurarse de que el medio no se acumule en ellas. Si el medio se está acumulando, pellizcar el tubo de salida generalmente promoverá un drenaje adecuado; para recolectar los biofilms, detenga la bomba y retire las agujas del reactor. A continuación, coloque el reactor sobre una superficie plana.

Después de tres días de flujo continuo, los biofilms de Staphylococcus aureus aparecen como biomasa amarilla distribuida a lo largo de la superficie de las placas inoculadas. Una micrografía electrónica de barrido del biofilm revela a Staphylococcus aureus cubriendo la placa en una comunidad de biofilm asociada a la superficie. Para cuantificar la biomasa obtenida, utilice pinzas estériles para retirar las placas de forma aséptica, recolecte las bacterias usando un raspador celular y luego transfiéralas a un tubo cónico que contenga cinco mililitros de PBS estéril.

Utilizando un tejido, desagregue los cúmulos bacterianos con un homogenizador hasta obtener una suspensión uniforme. Las unidades formadoras de colonias se cuantifican mediante la siembra de diluciones seriadas en placas de tripticaso soya, incubando durante 24 horas a 37 grados Celsius y contando las colonias. El reactor de biopelícula con disco rotatorio consta de un quimiostato a través del cual se bombea el medio de crecimiento.

Un disco giratorio con una barra en forma de estrella y 18 cupones diseñados para encajar en el disco giratorio. Para armar el reactor, primero cargue los cupones del disco giratorio en las ranuras del disco. A continuación, coloque el disco cargado dentro de un vaso de vidrio de un litro con un puerto de desbordamiento y tape el reactor con un tapón de caucho número 15 que tenga un orificio para el flujo del medio y otro para la aireación.

Sterilice el sistema autoclavando el reactor ensamblado y los tubos de entrada. Para inocular el reactor, llene el vaso con 250 mililitros de medio de cultivo estéril y agregue 500 microlitros de un cultivo nocturno de Staphylococcus aureus crecido en caldo de soya tripticasa. Coloque el reactor sobre una placa agitadora ajustada a 250 rotaciones por minuto e incube durante la noche a 37 grados Celsius para permitir que las células se adhieran a las muestras.

Tras la incubación nocturna, conecte el tubo de entrada al puerto del depósito de medio y a la bomba peristáltica. Encienda la bomba y ajuste el flujo a 0,25 mililitros por minuto. Permita que el reactor funcione durante 24 horas a 37 grados Celsius para recolectar los biofilms resultantes.

Detenga el reactor de forma aséptica. Retire el disco sin tocar las muestras. Utilizando pinzas estériles, retire las muestras y sumerja cuidadosamente cada una en PBS estéril para eliminar las bacterias débilmente adheridas antes de la prueba del compuesto antimicrobiano.

De forma aséptica, coloque las muestras en pozos individuales de una placa de 96 pozos que contenga los compuestos de interés. Incube la placa durante cuatro horas a 37 grados Celsius. Luego, transfiera las muestras a tubos microcentrífugos de 1,5 mililitros que contengan PBS 1X y disperse las biopelículas utilizando un homogenizador.

Finalmente, siembre diluciones seriadas de las células en medio de agar nutriente para determinar el número de unidades formadoras de colonias viables por muestra, como se describió anteriormente. Este gráfico muestra el número de unidades formadoras de colonias en biopelículas preparadas utilizando el reactor de disco giratorio y expuestas al peróxido de hidrógeno, con la capacidad de producir hasta 18 biopelículas idénticas. El uso del reactor de disco giratorio hace que esta técnica sea ideal para la prueba de compuestos antimicrobianos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo operar biopelículas en reactores de flujo por goteo y de disco rotatorio. Estos reactores de biopelícula ofrecen alternativas a las biopelículas en celdas de flujo y placas de microtitulación, y son ideales cuando se necesita una gran cantidad de biomasa de biopelícula o se desea realizar pruebas antimicrobianas sobre biopelículas establecidas.