Asistida por ordenador a gran escala de visualización y cuantificación de los islotes pancreáticos, distribución de tamaño y arquitectura

El objetivo general de este procedimiento es obtener datos representativos imparciales dentro de una muestra limitada y analizar con precisión la compleja estructura tridimensional del tejido. Esto se logra primero capturando cortes virtuales de secciones pancreáticas teñidas inmunohistoquímicamente. Luego, los cortes virtuales se cuantifican con la macro de corte virtual IHC en el software ImageJ, y los datos se analizan con secuencias de comandos escritas para Mathematica.

A continuación, se realiza una reconstrucción 3D de las rebanadas virtuales utilizando Image J. El paso final del procedimiento consiste en capturar una serie de imágenes individuales de los islotes mediante el software slide book y mapear manualmente las series de imágenes en tres dimensiones usando stereo investigator. En definitiva, mediante un método combinado de imagen 3D y mapeo manual, se puede obtener una arquitectura precisa de los islotes con coordenadas tridimensionales para cada célula del islote. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de los estudios sobre obesidad y diabetes, como cómo las condiciones fisiológicas y patofisiológicas afectan la distribución y arquitectura del islote pancreático y la masa de células beta.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el diagnóstico o tratamiento de la obesidad y la diabetes Melitis, ya que una mejor comprensión de los cambios en la masa de células beta facilitará el desarrollo y la evaluación de intervenciones terapéuticas. Aunque los métodos descritos en el presente estudio proporcionan información específica sobre el análisis inmunohistoquímico dinámico del páncreas, también pueden aplicarse a una variedad de otros organismos y tejidos. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de análisis asistido por computadora son difíciles de aprender.

Debido a la complejidad de analizar conjuntos de datos tan grandes en dos y tres dimensiones, comience este procedimiento colocando un portaobjetos limpio que contenga una sección completa de un páncreas teñido químicamente mediante inmunohistoquímica en el portaobjetos del microscopio fluorescente. Abra el software Stereo Investigator y visualice la muestra haciendo clic en adquisición.

Y luego la imagen en vivo. Determine los niveles de exposición para cada canal utilizando la ventana del histograma de video, que muestra la intensidad de la fluorescencia. En este ejemplo, el canal dos se utiliza para DAP P, el canal tres para GFP, el canal cuatro para RFP, el canal cinco para sci cinco y el canal seis para SCI siete.

Mediante la ventana de configuración de la cámara, ajuste el nivel de exposición para que la intensidad de fluorescencia disminuya. En el extremo derecho del histograma del video, se puede enfocar la imagen utilizando la rueda de enfoque del microscopio. Antes de crear una rebanada virtual, delimite la muestra haciendo clic en la pantalla en un punto alejado de la muestra, lo que marcará un punto de referencia.

Luego, haga clic alrededor del contorno de la muestra cuando el contorno esté completo. Haga clic con el botón derecho y seleccione cerrar contorno para conectar los puntos inicial y final. Una vez cerrado el contorno, capture una rebanada virtual de la muestra seleccionando adquisición y luego adquiera la rebanada virtual. Cuando se abran las opciones de la ventana de rebanada virtual, seleccione adquisición de alta velocidad, así como desactivar manual.

Enfoque desactivando la casilla junto a manual. Guarde el archivo. Calibre el prefo haciendo clic derecho y seleccionando agregar a la lista de sitios de enfoque.

Enfoque manualmente varias secciones aleatorias en la vista previa del corte virtual. Cuando se hayan enfocado varios sitios, inicie el corte virtual haciendo clic derecho y seleccionando. Inicie el corte virtual con prefo; una vez completado el corte virtual para la primera muestra, cambie al siguiente canal y ajuste el tiempo de exposición en consecuencia. Este procedimiento se repite para cada canal con el fin de realizar la cuantificación de los orificios; procese las imágenes utilizando una macro de ImageJ denominada I-H-C-V-S, que primero prepara las imágenes cargadas para el análisis y luego cuantifica características de los orificios, como la composición celular.

La macro I-H-C-V-S divide la pila en sus canales de color respectivos. En Image J, convierte cada imagen en una máscara en blanco y negro de ocho bits. Después del umbral automático de intensidad, suma aritméticamente las imágenes de los canales separados en una máscara compuesta.

El análisis de partículas integrado en Image J sobre la imagen compuesta identificará entonces regiones de interés o ROI, excluyendo al mismo tiempo partículas más pequeñas que una célula beta. La cuantificación de las ROI. El uso de Image J produce una hoja de cálculo con parámetros celulares.

Guarde los resultados agregados en una hoja de cálculo de Excel. Almacene datos como área, perímetro, circularidad, diámetro fer, y centro del ojal para cada ojal, junto con los números correspondientes etiquetados en la imagen. Se puede realizar el análisis computacional de estos parámetros según se describe en el protocolo escrito. Para obtener información que incluya distribución y análisis de frecuencia de los ojales, realice una reconstrucción 3D de cortes virtuales ejecutando un script que convierta todas las imágenes JP2 del directorio en archivos TIF, que es el formato utilizado en la construcción y cuantificación de pilas tridimensionales a partir de los cortes virtuales.

Aquí se utiliza un script llamado I MJ dos dos tiff. Copie el script en el directorio que contiene las imágenes JP dos. Ejecute el script con el shell de Linux escribiendo punto barra diagonal I am JP dos dos TIFF en la consola y luego presionando enter.

Una vez que todas las imágenes capturadas se hayan convertido de JP2 a archivos TIFF, estarán listas para ser utilizadas en el análisis con ImageJ. Mediante ImageJ, abra todas las imágenes de la primera muestra, que en este caso provienen de un páncreas fetal humano, y combínelas en una sola seleccionando imagen, color y luego fusionar canales. Repita este proceso para cada una de las muestras. Cuando todas las muestras hayan sido combinadas en imágenes individuales, limpie las imágenes seleccionando las regiones no deseadas con la herramienta de selección poligonal.

Rellénelos seleccionando editar y luego rellenar. Convierta cada imagen en una imagen de color RGB. Finalmente, cree una pila con las imágenes, tras lo cual pueden alinearse aún más utilizando el complemento stack reg.

En última instancia, la combinación de los canales y la fusión de las imágenes crea un mosaico tridimensional de todos los islotes pancreáticos en todo el páncreas. Para recopilar series de imágenes, coloque los islotes pancreáticos montados completamente bajo el microscopio. Aplique agua si utiliza un objetivo de inmersión en agua.

Abra el software del libro de portaobjetos, acceda al control de captura y enfoque presionando control más mayúsculas más E en la ventana de control de enfoque. Establezca el objetivo en 20 veces o 40 veces según el tamaño del ojal. Para usar el ocular del microscopio y localizar los ojales, configure la binarización en dos veces y el conjunto de filtros en usuario uno.

En la ventana de control de enfoque, la selección de emisión debe ajustarse a 100%. La densidad neutra debe establecerse en un clic para GFP ey, y luego abrir el piso para visualizar la muestra en el libro de diapositivas. Volver a la ventana de control de enfoque y cambiar el juego de filtros a fijo. A continuación, hacer clic en G-F-P-D-S. Utilizar la palanca de mando para centrar lo más posible el orificio en la ventana de la cámara.

Enfocar a una profundidad cercana al centro del orificio donde las células puedan distinguirse fácilmente. En la ventana de control de enfoque, seleccionar el zab. Utilizar el control del microscopio para desplazarse hasta la profundidad más alta del orificio en la que las características se puedan discernir claramente y hacer clic en establecer arriba.

Desplácese hasta la parte inferior del ojal y haga clic en establecer. Haga clic en inferior para avanzar. Para regresar al punto de referencia en la ventana de captura, haga clic en avanzado y luego en alternar al modo de canal.

Establezca el factor de bining en dos y el tipo de captura en 3D en el lado derecho de la ventana; haga clic en usar posiciones superior e inferior y regrese al volumen central después de la captura. Establezca el tamaño de paso en tres. Establezca el juego de filtros en vivo debajo del cuadro del juego de filtros.

Seleccione DAP, E-D-S-U-G-F-P-D-S-U-R-F-P-D-S-U y SCI cinco DSU. Para cada uno, haga clic en encontrar el mejor valor en ajustar exposición. Luego haga clic en probar para asegurarse de que la exposición seleccionada sea adecuada.

Haga clic en iniciar para comenzar la captura. Cuando finalice la captura, ajuste los niveles según sea necesario y cambie el color mostrado para RFP a blanco. Guarde la diapositiva y vaya a ver exportar serie TIFF.

Escriba el nombre del portaobjetos con un guion al final y guárdelo. Se crean docenas de archivos TIF individuales, por lo que puede ser útil mantener cada pila de imágenes de orificios en una carpeta separada. Para mapear las pilas de imágenes, abra el software Stereo Investigator.

Visualice la imagen abriendo las pilas de imágenes en el menú de escala de imagen. Establezca la distancia entre imágenes en tres micrones para corregir la flexión dos veces. En el libro de diapositivas, seleccione sobrescribir la escala X e Y y utilice un valor especificado para la fuente de escala X e Y.

Introduzca 0,65 para ambos centros X e Y y acerque la imagen haciendo clic en el botón de zoom, y luego en el centro del ilote de interés en la ventana macro marque al menos una célula. Mediante el marcador adecuado, las células beta aparecerán verdes. Las células alfa aparecerán rojas y las células delta aparecerán blancas.

Marque las células en el centro de su núcleo, que aparecerán en azul si la muestra ha sido teñida con DPI; utilice el marcador dos para marcar las células beta. El marcador cinco para marcar las células alfa, y el marcador seis para marcar las células delta. Una vez que se haya marcado al menos una célula, muestre la vista ortogonal utilizando el icono en el menú superior, active el filtro Z y la opción simétrica.

El rango debe establecerse en 15,00. Comenzando en el 0,0 Z, desplácese por los orificios utilizando la rueda del ratón y marque cada célula con la marca de marcador adecuada, marcando cada célula solo una vez en el centro de su profundidad. Al terminar de marcar cada uno de los niveles Z, se puede desactivar la casilla de verificación del filtro Z.

Esto mostrará todos los marcadores de todos los niveles Z. Cuando se haya marcado cada célula, guarde el archivo como un archivo DAT. Luego vaya a exportar trazado del archivo.

Guarde el trazado como un archivo TXT. Finalmente, haga clic en nuevo archivo de datos para limpiar el área de trabajo antes de intentar mapear nuevos ojales. La preparación de cortes virtuales a partir de una muestra de páncreas teñida mediante inmunohistoquímica permite examinar las células endocrinas alfa, beta y delta en todo el páncreas juntas como islotes; la tinción inmunohistoquímica para insulina puede observarse en verde, glucagón en rojo, somatostatina en blanco y dap en azul.

Las imágenes se convirtieron luego a una máscara de ocho bits tras el umbral automático. Se muestra aquí la imagen compuesta fusionada. Sin embargo, la distribución de ojalillos mediante rebanada virtual también permite el análisis individual en canales separados.

Aquí, se muestran vistas de cada canal para revelar las células delta, células beta y células alfa. Se realiza un análisis de partículas sobre una máscara compuesta que muestra cada estructura de orificio numerada y resaltada en azul. El análisis de partículas de las máscaras compuestas se genera como una tabla de datos que contiene parámetros como área de las islas, perímetro, circularidad y diversos diámetros para cada orificio detectado, cuyos identificadores corresponden a las etiquetas numeradas en la máscara compuesta.

El análisis a gran escala de estas imágenes da como resultado la producción de histogramas del número total de islotes y de la distribución de su tamaño, así como comparaciones detalladas de las áreas de las células alfa, beta y delta. El mapeo de islotes y el análisis matemático de la composición celular y la arquitectura pueden revelar un único plano focal a partir de una pila de imágenes tridimensionales reconstruidas de islotes humanos cargados en Stereo Investigator. Aquí, las células beta aparecen en verde, las células alfa en rojo, las células delta en blanco y los núcleos en azul.

Después de la captura de eyelets distintos, las células alfa, beta y delta se marcan en varios planos marinos aquí; se muestran imágenes fluorescentes y los datos de mapas correspondientes para tres planos focales diferentes con un intervalo de 10 micrómetros. Una vez que las células alfa, beta y delta han sido marcadas en varios planos, el eyelet puede visualizarse en 3D. Aquí se muestra una reconstrucción en 3D del eyelet cortado en cuartos basada en las coordenadas obtenidas mediante el mapeo del eyelet.

Además, el análisis matemático automatizado de los orificios cartografiados puede mostrar la composición y arquitectura celular. Aquí se muestra la frecuencia relativa de las distancias entre células dentro de una sola población celular. También se muestra la frecuencia relativa de las distancias entre células de dos poblaciones celulares diferentes.

También se muestran las probabilidades acumuladas de las distribuciones de distancias entre célula y célula para células alfa a alfa, beta a beta y delta a delta. Se puede realizar la prueba de Kolmogorov-Smirnov o KS sobre estas probabilidades para obtener las distancias KS correspondientes. Una vez dominadas, la obtención de imágenes a gran escala y el análisis de una sección tisular completa pueden realizarse en cuatro horas.

La reconstrucción 3D de un bloque de tejido puede realizarse en 30 minutos. Finalmente, la imagenología 3D y el mapeo manual pueden completarse en cuatro horas si se realizan adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante comenzar con una tinción inmunohistoquímica de alta calidad de las secciones.

La precisión del análisis posterior dependerá completamente de los datos brutos. Asimismo, asegúrese de que sus computadoras tengan al menos ocho gigabytes de RAM para procesar este tipo de análisis a gran escala tras su desarrollo. Esta técnica allanó el camino para los investigadores, no solo en el campo de la obesidad y la diabetes, sino ampliamente en muchos otros campos que utilizan el análisis patológico estándar.

Puede ser especialmente útil cuando la disponibilidad de muestras es limitada. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo recopilar datos representativos imparciales dentro de un tamaño de muestra limitado utilizando técnicas estándar. Seleccionar únicamente una región específica puede no ser representativo del panorama completo, tal como hemos demostrado mediante nuestro estudio sobre la distribución de islotes pancreáticos.