Mutagénesis y funcional protocolos de selección de la evolución dirigida de proteínas en E. coli

El objetivo general de este procedimiento es crear una biblioteca de mutantes aleatorios para una secuencia de ADN diana determinada, y para identificar y caracterizar rápidamente los mutantes mediante una selección funcional semicuantitativa. Esto se logra primero transformando un plásmido con una cepa de coli, que contiene un origen de replicación con la secuencia diana, en la cepa mutadora. Después de sembrar e incubar las células durante la noche, se recolectan y se aísla el plásmido diana para obtener la biblioteca de mutantes; luego, esta biblioteca de mutantes se transforma en una cepa indicadora para caracterizar las mutaciones en la segunda parte del protocolo. Se construye una placa de crecimiento en gradiente y cultivos bacterianos de la cepa indicadora se cargan en una placa de Petri separada que contiene agar blando.

El paso final del procedimiento consiste en transferir por impresión estas culturas bacterianas al gradiente. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran cambios en el perfil fenotípico de una secuencia diana determinada mediante diferencias en el crecimiento sobre un gradiente de fármaco. Este video presenta un método para la evolución dirigida de proteínas en e coli.

Este proceso imita la evolución natural en la generación de bibliotecas aleatorias de nutrientes, seguida de una selección que restringe esa diversidad. De este modo, mejora nuestra capacidad para generar nuevas actividades bioquímicas con fines industriales o biomédicos. Este procedimiento tiene dos componentes: la generación de una biblioteca mutante aleatoria y la selección funcional para obtener mutaciones con ganancia de función. La persona que demostrará este procedimiento será Jennifer Allen, una técnica de mi laboratorio.

Antes de comenzar este protocolo, considere células electrocompetentes JS200 que expresan una variante de baja fidelidad de la ADN polimerasa uno o pole de baja fidelidad, que previamente se han preparado según se describe en el protocolo escrito. Estas células contienen un alelo sensible a la temperatura de pole uno, de tal manera que la actividad de pole uno de baja fidelidad predomina a 37 grados Celsius. Construya un plásmido diana que contenga un origen de replicación coli uno, con la secuencia diana clonada adyacente al origen de replicación. Pole uno de baja fidelidad inicia la replicación del plásmido coli uno, introduciendo así mutaciones para iniciar la mutagénesis.

Combine 40 microlitros de células electrocompetentes y entre 30 y 250 nanogramos de ADN plasmídico diana en un espacio de dos milímetros. Realice la electroforesis con un impulso vet en el electro a 1800 voltios. Verifique la constante de tiempo o TC para asegurar condiciones de transformación uniformes para cada muestra.

El TC idealmente debe ser de cinco a seis milisegundos. Permita que la mezcla de ADN celular se recupere en un mililitro de caldo LB durante 40 minutos a 37 grados Celsius con agitación a 250 RPM. Obtenga una placa de Petri LV agro de 100 milímetros precalentada a 37 grados Celsius que contenga los antibióticos adecuados para seleccionar ambos plásmidos; plaque las células recuperadas a una dilución apropiada para obtener una concentración cercana a una capa continua, definida como un número distinto pero incontable de colonias como se muestra en este ejemplo.

Tras la incubación nocturna, recolecte las colonias bacterianas de las placas de Petri con caldo LB. Aísle el plásmido, ADN de las células recolectadas; el plásmido resultante constituye la biblioteca de mutantes aleatorios.

Realice una digestión con enzima de restricción cortando la biblioteca de plásmidos con una enzima de restricción que linealice tanto el plásmido diana como el polo. En un plásmido, realice un gel analítico de aro en el ADN plasmídico aislado para confirmar la calidad y la cantidad. Una vez verificados los plásmidos, digiera un microgramo de la biblioteca con una enzima de restricción que linealice el plásmido del polo, pero que no corte el plásmido diana.

Una vez finalizada la digestión con enzima de restricción, purifique la biblioteca utilizando un kit de purificación de ADN. Finalmente, transforme la biblioteca purificada en una cepa indicadora para caracterizar las mutaciones. Para comenzar la preparación del gradiente, marque 10 carriles espaciados uniformemente a lo largo de un borde del fondo de la placa de Petri cuadrada.

Coloque el plato en una inclinación de modo que el borde inferior marcado quede elevado siete milímetros. Vierta 25 mililitros de agar LB tibio mezclado bien con una concentración adecuada del agente selectivo en el plato inclinado. Esta es la capa inferior del gradiente.

Asegúrese de que el agar LB cubra la placa de Petri de manera que el extremo elevado marcado de la placa contenga aproximadamente un milímetro de agar LB, y la parte inferior contenga unos ocho milímetros. Cubra la placa con la tapa KU para ventilación y deje que el agar se solidifique durante 10 a 15 minutos. Una vez que la capa inferior de agar LB se haya endurecido, traslade la placa a una superficie plana.

A continuación, vierta 25 mililitros de agar LB tibio sin el agente selectivo para recubrir la superficie del primer agar, asegurándose de cubrir completamente la capa inferior. Cubra la placa con la tapa KU para ventilación y luego deje que el agar se solidifique durante 10 a 15 minutos para realizar la transferencia por estampado de bacterias. Primero, obtenga cultivos bacterianos de la cepa indicadora y dilúyalos para tener densidades celulares idénticas con una densidad óptica a 600 nanómetros menor a 1,0.

A continuación, transfiera dos mililitros de agar blando líquido equilibrado a 42 grados celsius al fondo de una placa de Petri redonda de 100 milímetros, pipetee 40 microlitros de la cultura bacteriana al agar blando y luego mezcle moviendo suavemente la placa. Recubra el borde largo del portaobjetos de vidrio con la mezcla de agar blando. Alinee entonces el borde recubierto del portaobjetos con la marca inferior en el recipiente con gradiente.

Toque la placa con la superficie del agar. Un contacto suave es suficiente para transferir una cinta de agar blando a la superficie del gradiente. Luego, se aparta la placa para limpiarla y reutilizarla.

Repita este proceso. Las muestras restantes y los controles experimentales deben incluirse en cada placa con gradiente. Si se realizan varios gradientes, incube la placa con gradiente boca abajo durante la noche a 37 grados Celsius; los tiempos y las temperaturas de incubación pueden variar según las cepas bacterianas utilizadas para la lectura, pero generalmente es suficiente una incubación nocturna a 37 grados Celsius para observar crecimiento visible.

Finalmente, capture y analice el crecimiento celular según se describe en el protocolo escrito. A continuación se muestran imágenes de una cepa indicadora transformada con una biblioteca P-G-F-U-V silenciada o con una biblioteca mutante de PG FPUV que fueron procesadas. Colonias oscuras o tenues tras cuatro rondas de mutagénesis indican plásmidos que contienen mutaciones inactivadoras de GFP.

Esta figura representa la frecuencia de mutaciones a lo largo de la secuencia neutra del plásmido diana en intervalos de 100 pares de bases. Obsérvese que las mutaciones ocurren en toda la secuencia del plásmido, pero con la mayor frecuencia cerca del origen de replicación. Aquí, el crecimiento de los mutantes se muestra frente a un gradiente del fármaco.

La distancia crecida hacia la parte superior del gradiente indica un perfil diferencial de resistencia a fármacos entre los mutantes. En este ejemplo, bibliotecas de plásmidos de la demetilasa oxidativa humana ABH dos fueron analizadas en busca de mutantes con resistencia incrementada al metil metanosulfonato utilizando gradientes de selección con fármacos. Dos. Dichas bibliotecas, que representan dos y cuatro iteraciones del protocolo de mutagénesis, se muestran en comparación con el tipo silvestre parental y el vector vacío.

La línea blanca indica el umbral por encima del cual se aislaron colonias mutantes individuales. Para análisis fenotípico adicional, se muestran mutantes de beta-lactamasa, R 1 64 H y E 1 0 4 KR 1 64 HG 2 67 R, previamente identificados mediante mutagénesis con baja fidelidad P uno y selección astri y m, en gradientes de 0,4 microgramos por mililitro y cuatro microgramos por mililitro. La protección frente a cefotaxima es indicativa de actividad de beta-lactamasa de espectro extendido.

Téngase en cuenta que la enzima beta-lactamasa de tipo silvestre no confiere protección alguna en comparación con las células que expresan un vector vacío. Por lo tanto, estos mutantes representan una adaptación o la evolución de una nueva actividad bioquímica. Aquí hemos presentado una combinación poderosa de mutagénesis y selección funcional para la generación de nuevas actividades bioquímicas.

Una selección funcional puede obtenerse mediante selección con fármacos o mediante complementación genética, y aprovecha nuestra capacidad para generar una gran diversidad genética. La patogénesis puede tener que restringirse a una secuencia determinada para optimizar actividades proteicas preexistentes o para una patogénesis dirigida a un sitio específico. Esto puede hacerse fácilmente mediante clonación.

Además, la mutagénesis puede separarse de una selección funcional para obtener ataques característicos o huellas mutacionales.