Colonia de levaduras Método de anidamiento
22 de marzo de 2011
Un método para la incorporación de colonias de levadura que permite el corte de luz y microscopía electrónica. Este protocolo permite la determinación de la distribución de células y las células esporuladas pseudohyphal dentro de las colonias de proporcionar una nueva herramienta en la comprensión de la organización de los tipos de células dentro de una comunidad de hongos.
El objetivo general de este procedimiento es incrustar colonias de levadura. Esto se logra primero retirando una colonia junto con el agar debajo de ella desde una placa de agar, colocándola sobre varias gotas de agar fundido y cubriéndola rápidamente con más agar fundido. A continuación, se recorta el exceso de AER de la colonia para hacerla lo suficientemente pequeña como para que quepa en un molde.
La colonia incrustada en la EMA se fija, tiñe, deshidrata e, finalmente, se infiltra con resina de spurs. El bloque se coloca entonces en un molde con resina de spurs adicional y se incuba hasta que endurezca, para luego seccionarlo. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren la distribución de los tipos celulares dentro de una colonia de levadura mediante microscopía óptica o electrónica.
La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la microscopía electrónica de barrido es que permite determinar la estructura interna de la colonia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo microbiano, como la distribución de los tipos celulares dentro de las colonias. Este método proporcionó información sobre la estructura de las colonias de croce CAC, pero es probable que también pueda aplicarse a otros microorganismos.
La demostración visual de este método es fundamental, ya que la manipulación e inclusión de colonias puede ser difícil de aprender a partir de un protocolo escrito. La idea para este método se inspiró en algunos datos genéticos que publicamos en 2002, los cuales sugerían que las esporas no estaban distribuidas uniformemente en las colonias. Adaptamos un método para seccionar colonias que fue desarrollado por engelberg en el laboratorio de fin.
Así que comencemos. Incube inicialmente levadura Wild S visi en placas con agar a 30 grados hasta que haya aproximadamente 300 colonias. Utilizando una espátula estrecha, retire las colonias de uno a dos milímetros de diámetro, una a la vez, de la placa.
Luego, utilizando una punta para pipeta de un mililitro, coloque varias gotas de agar al 2% a 42 grados Celsius sobre un portaobjetos de microscopio, y coloque inmediatamente la colonia sobre el agar con la cara hacia arriba antes de que el AER se solidifique. Añada varias gotas más de agar sobre la colonia y deje que el agar se solidifique, asegurándose de que toda la colonia, incluida su parte superior, quede completamente rodeada por el agar. En todos los pasos posteriores del protocolo, utilice una cuchilla de afeitar.
Recorte el AER alrededor de la colonia y coloque el bloque de AER que contiene la colonia. En un vial de 3,5 mililitros de borosilicato con tapa roscada que contenga fijador de paraformaldehído al 2% y glutaraldehído al 2%, las colonias deben procesarse, una a la vez para evitar el secado, aunque se pueden colocar hasta 10 colonias en el mismo vial. Deje las colonias durante siete días a cuatro grados Celsius.
Después de una semana, retire el fijador y lave las colonias de agri dos veces, utilizando aproximadamente 1,5 mililitros de cloruro de sodio 0,15 molar a pH 7,2 e incube en hielo tras cada lavado durante 15 minutos sin agitación. A continuación, lávese dos veces más.
Utilizando 1,5 mililitros de un tampón X OS, compuesto por fosfato monopotásico 100 milimolar, cloruro de magnesio 10 milimolar a pH 6,0, incubar en hielo durante cinco minutos tras cada lavado. A continuación, utilizando el mismo vial, realizar el tratamiento con osmio y los lavados indicados aquí y en la parte escrita de este protocolo. Luego nuevamente, utilizando el mismo vial, realizar las deshidrataciones escalonadas indicadas aquí y en el protocolo escrito adjunto a primera hora de la mañana siguiente.
Prepare el reactivo spurs como se muestra aquí y en el protocolo escrito adjunto. Lave inmediatamente los bloques de agri cinco veces durante 10 minutos cada uno con 1,5 mililitros de etanol al 100 % a temperatura ambiente. Después del último lavado con etanol, retire solo la cantidad suficiente de etanol para que el bloque de agri permanezca cubierto.
Usando una pipeta Pasteur, coloque aproximadamente 0.5 mililitros del reactivo de espolones en el vial y rote en una rueda a baja velocidad durante 15 minutos. A temperatura ambiente después de la rotación, deje reposar el vial durante 30 minutos. A continuación, retire completamente la solución.
Luego, agregue 1.5 mililitros del reactivo spurs para cubrir el bloque agri. Nuevamente, rote el vial en una rueda durante 15 minutos a temperatura ambiente y déjelo reposar durante 30 minutos. Repita este lavado.
Repita el paso tres veces más. Después de los últimos 30 minutos, retire el reactivo spurs y agregue reactivo spurs fresco para cubrir los bloques. Deje reposar los bloques agri a temperatura ambiente durante cuatro horas.
Sustituya el reactivo Spurs y rote durante la noche. A la mañana siguiente, sustituya el reactivo Spurs y deje los viales rotando hasta el día siguiente. A la mañana siguiente, coloque el reactivo Spurs en moldes de silicona numerados para cubrir apenas el fondo de los moldes.
A continuación, coloque los bloques de agar en los moldes e incube a 60 grados Celsius durante cuatro horas. Después de cuatro horas, complete los moldes con más espumas, reactivo, e incube a 60 grados Celsius durante la noche. Retire los bloques del molde para su seccionado.
Se muestra aquí un ejemplo de una micrografía luminosa de una sección a través del centro de una colonia de levadura Silvestre S Visia. Esta levadura es una cepa tipo silvestre aislada de exudados de árboles. La colonia se incubó durante seis días en medio YNA antes de la sección.
En esta imagen, las formas asai, pseudo hyphy y las levaduras ovoides son fácilmente distinguibles, y también es evidente la región de la colonia que invade el agar subyacente. Las flechas abiertas indican representantes asai, las flechas rellenas indican células vegetativas ovoides representativas y las puntas de flecha rellenas indican cadenas de células alargadas y si. Esta imagen es un ejemplo de un micrografía electrónica de un corte delgado de una cepa de laboratorio de levadura SH 1 0 2 0 y W 3 0 3. Antecedentes.
La colonia se incubó durante seis días en medio YNA antes de la sección. La imagen muestra una región de la colonia que contiene una alta frecuencia de células esporuladas. Una flecha indica la estructura de doble capa de la pared del esporo.
En la parte A, se muestra una sección de una colonia de cuatro días con una cuadrícula compuesta por 15 rectángulos superpuestos sobre la imagen en la parte B. La frecuencia de células relacionadas con esporas en cada rectángulo se representa mediante 15 barras que corresponden a los 15 rectángulos mostrados en la parte A. Los datos corresponden a la media y al error estándar de cuatro colonias independientes de cuatro días. En la parte C, se presentan las medias y los errores estándar de cuatro colonias independientes de ocho días. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en dos semanas con un día completo y varios días de una a tres horas. Al intentar este procedimiento, es importante recordar agregar las soluciones inmediatamente para que los bloques no se sequen tras seguir este procedimiento.
Otros métodos, como la microscopía electrónica inmunológica, podrían utilizarse posiblemente para determinar la distribución de células que expresan proteínas particulares tras su desarrollo. Esta técnica nos permitió observar no solo el patrón de las células esporuladas, sino también el patrón de las células pseudo hifales en colonias croce CCI. Tras ver este video, deberías tener una buena comprensión de cómo incrustar colonias de levadura para su seccionado.
No olvide que muchos de los reactivos de microscopía utilizados en este protocolo pueden ser extremadamente peligrosos. Recuerde utilizar una campana extractora, usar ropa protectora y desechar los reactivos adecuadamente. Bien, eso es todo.
Gracias por ver el video. Buena suerte con sus experimentos.
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Descripción general
Este artículo presenta un método para incrustar colonias de levadura, lo que permite su seccionado para microscopía óptica y electrónica. El protocolo facilita el análisis de células esporuladas y pseudofilamentosas dentro de las colonias, contribuyendo a la comprensión de la organización de los tipos celulares en comunidades fúngicas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Biología Celular
- Biología Fúngica
Antecedentes
- Las colonias de levaduras exhiben diversos tipos de células.
- Comprender la distribución celular es crucial para estudiar las comunidades fúngicas.
- Los métodos tradicionales pueden no proporcionar información detallada sobre la organización celular.
- Este método ofrece un enfoque novedoso para la visualización.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un protocolo para incrustar colonias de levaduras.
- Permitir un análisis detallado de la distribución de tipos celulares.
- Mejorar la comprensión de la organización de comunidades fúngicas.
Métodos Utilizados
- Eliminación de colonias de levaduras de placas de agar.
- Inclusión de colonias en agar fundido.
- Recorte del exceso de agar para ajustarlo a los moldes.
- Fijación, tinción, deshidratación e infiltración con resina.
Resultados principales
- Embebido exitoso de colonias de levadura para microscopía.
- Visualización de células esporuladas y pseudofilamentosas.
- Análisis detallado de la distribución de tipos celulares dentro de las colonias.
- Nuevas perspectivas sobre la organización de comunidades fúngicas.
Conclusiones
- El método de inclusión es efectivo para el análisis por microscopía.
- Proporciona una herramienta valiosa para estudiar la estructura de colonias de levaduras.
- La investigación futura puede basarse en este método para explorar las interacciones fúngicas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Comprender la organización espacial de los tipos celulares dentro de comunidades microbianas facilita la validación de objetivos en el descubrimiento de antimicrobianos y antifúngicos. Este método permite reducir riesgos mecanicistas al revelar la heterogeneidad fenotípica que podría influir en la respuesta al fármaco y en el desarrollo de resistencia. Proporciona confianza predictiva en ensayos de etapas iniciales al vincular la arquitectura de la colonia con subpoblaciones funcionales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la comprobación de hipótesis terapéuticas mediante la visualización de la distribución de células esporuladas y pseudofilamentosas dentro de las colonias.
- Valor operativo: Facilita la reducción de riesgos biológicos mediante la observación directa del patrón de tipos celulares asociado a estados funcionales.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para flujos de trabajo posteriores mediante la preservación de las relaciones espaciales de los tipos celulares.
- Valor operativo: Aborda la estandarización y reproducibilidad de ensayos mediante la sección e imagen consistentes de las estructuras internas de las colonias.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Analiza la relevancia de la enfermedad mediante la visualización de regiones de colonias invasoras que modelan la penetración microbiana en los tejidos del huésped.
- Valor operativo: Describe la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al permitir la correlación estructural con resultados fenotípicos.
Integración de la Línea de Producción y Flujo de Trabajo
Sitúa el método dentro del descubrimiento temprano para la identificación de fármacos, al permitir la fenotipificación estructural que orienta las decisiones de cribado de compuestos.
- Biología del Descubrimiento: Explica cómo el método apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante la obtención de imágenes directas de la distribución asimétrica de células.
- Selección: Describe la preparación del ensayo mediante la producción de secciones gruesas y delgadas compatibles con microscopía óptica y electrónica.
- Análisis: Destaca los resultados cuantitativos, como la elaboración de mapas de frecuencia de células esporuladas en distintas regiones de la colonia para análisis comparativo.
- Investigación Traducional: Relaciona el método con la continuidad preclínica al vincular los frentes invasivos de las colonias con modelos de penetración tisular.
- Reutilización Empresarial: Presenta el método como una capacidad reutilizable para el análisis estructural en múltiples cepas y condiciones fúngicas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva, validación de objetivos y reducción de la ambigüedad mecanicista en el comportamiento de comunidades microbianas.
- Valor operativo: Normalización, reproducibilidad y escalabilidad de la preparación de colonias para tuberías de microscopía multiusuario.
- Valor estratégico: Mejores decisiones de avance o interrupción, eficiencia del capital y reducción del riesgo biológico en fases avanzadas mediante la eliminación temprana del riesgo fenotípico.
- Impacto en la cartera: Priorización y toma de decisiones de avance ajustadas al riesgo, basadas en biomarcadores estructurales de virulencia o persistencia.
Consideraciones de Implementación
- Conocimientos científicos especializados en histología, microscopía y manejo de microorganismos.
- Requisitos de instrumentación e infraestructura analítica, incluyendo microtomos, microscopios ópticos y electrónicos, y sistemas de infiltración con resina.
- Requisitos de estandarización entre equipos para protocolos de fijación, tinción y corte entre grupos de microbiología y de imagen.
- Consideraciones de adaptación en diferentes sistemas modelo, como bacterias formadoras de biopelículas u otras especies de levaduras con morfología de colonia variable.
- Limitaciones prácticas respaldadas por la documentación de origen, incluyendo restricciones de tamaño de colonia (diámetro de 1-2 mm) y tiempo de procesamiento de varios días que requiere técnica estéril para prevenir contaminación.
