Una analítica Caja de Herramientas para la Evaluación Integral de bioquímica, estructural y transcriptoma de biopelículas oral mediada por Streptococcus mutans

Los biofilms formados en las superficies dentales son altamente complejos y estructurados. Comunidades microbianas atrapadas en una matriz extracelular, que están expuestas a desafíos ambientales constantes. El objetivo general aquí es mostrar dos componentes específicos de una caja de herramientas analítica diseñada para facilitar estudios estructurales y moleculares, considerando la naturaleza compleja de los biofilms orales mediante la combinación de una técnica novedosa de imagen de fluorescencia con un software personalizado para el procesamiento y análisis de datos.

Esto se logra seleccionando primero ensayos específicos para el análisis de biopelículas, transcriptoma y estructura, incluyendo un nuevo enfoque de imagen confocal para la visualización simultánea de EPS y bacterias. El segundo paso del procedimiento consiste en recopilar los datos brutos provenientes de los bioensayos. El tercer paso es procesar los datos brutos utilizando software específico, incluyendo el recientemente desarrollado duo stat para el análisis de colocalización.

El paso final consiste en analizar los datos del proceso, incluido el uso de software de minería y organización de datos de microarreglos, visualizador de datos de microarreglos o MDV. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran cómo los patógenos orales modifican su transcriptoma y la arquitectura de los biopelículas en respuesta a una dieta compleja y a las interacciones huésped-microbianas, utilizando nuestra caja de herramientas analíticas integrada de forma única, lo que proporciona un análisis de biopelículas y una interpretación de datos más exhaustivos. Hola, mi nombre es Michelle Kuh, profesora asociada en el centro de biología oral aquí en el Centro Médico de la Universidad de Rochester.

Hoy presentamos un conjunto de herramientas analíticas para el análisis de biopelículas. Este conjunto de herramientas puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la investigación de biopelículas, como la forma en que las células de la biopelícula están estructuradas, organizadas con la matriz extracelular y cómo responden a desafíos ambientales complejos a nivel transcripcional. Mi nombre es Jean, ella, soy investigadora posdoctoral en el laboratorio del Dr. K.

Hoy voy a demostrar la parte de imágenes de nuestra caja de herramientas. Hola, soy Aise Klein. Soy profesora asistente de investigación en el laboratorio del Dr. Ks.

Hoy presentaré el software MDV para el análisis de datos de microrrayos. En este procedimiento, se utilizan discos de hidroxiapatito recubiertos con saliva como sustratos de superficie dentaria sobre los cuales se cultivan biofilms. Primero, agregue 2,8 mililitros de medio de cultivo inoculado con S. mutants en cada pocillo de una placa de 24 pocillos, protegiendo la placa de la luz, y añada el colorante LOR 6 47 conjugado con dextrina a cada pocillo hasta una concentración final de un micromolar, y pipetee hacia arriba y hacia abajo varias veces para mezclar el colorante con el medio de cultivo.

A continuación, utilizando fórceps estériles, sumerja y lave los discos de hidroxiapatita recubiertos con saliva estéril dos veces en tampón AB estéril para eliminar cualquier exceso de saliva o componentes salivales no unidos. Luego, coloque los discos verticalmente en el medio de cultivo suplementado con colorante, asegurándose de que cada disco quede completamente sumergido. Cubra la placa con papel de aluminio e incúbela a 37 grados Celsius en una incubadora con 5% de dióxido de carbono durante 20 horas para permitir la formación de biopelículas y la incorporación de la textura conjugada en los polisacáridos extracelulares producidos por las células bacterianas.

Para etiquetar primero las células bacterianas, prepare una placa de 24 pocillos con 2,8 mililitros de agua estéril milli Q por pocillo. Añada 1,5 microlitros de colorante citocina a cada pocillo hasta una concentración final de un micromolar y proteja la placa de la luz. Una vez que se haya formado el biofilm, retire la placa que contiene los discos del incubador y sumérjala.

Lave cada disco en una solución de cloruro de sodio al 0,89 %. Luego transfiéralos a la nueva placa que contiene el colorante citocromo. Cubra la placa con papel de aluminio e incúbela durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Una vez que las células hayan sido teñidas, sumerja y lave las biopelículas y el cloruro de sodio como antes. Luego, utilizando pinzas, libere las biopelículas del alambre hacia una placa de Petri que contenga cloruro de sodio. Envuelva la placa de Petri con papel de aluminio.

Los biofilms ya están listos para su visualización mediante microscopía confocal utilizando un microscopio confocal de barrido láser. Escanee cada biofilm en cinco a diez posiciones seleccionadas al azar y genere series Z en cada posición. Para permitir reconstrucciones tridimensionales, abra las imágenes confocales y procéselas utilizando un software de espejo.

Esta representación tridimensional de imágenes confocales generadas mediante el programa Amira muestra un biofilm de mutantes S formado sobre una superficie apática utilizando el procedimiento demostrado. Las células bacterianas y los microcolonias son visibles en verde y están embebidas en la matriz del biofilm que contiene exopolisacáridos. En rojo, se puede generar una vista ampliada de un área seleccionada, que ilustra la relación estructural específica entre las bacterias y los EPS a escala microscópica.

Utilice el programa duos stat para cuantificar la cantidad de colocalización de componentes separados del biofilm, como las bacterias y los polisacáridos extracelulares. Primero, configure la ruta del duos stat recién desarrollado en la versión 5.1 de MATLAB y abra las carpetas de imágenes que contienen las series Z de las dos componentes del biofilm. A continuación, seleccione dos canales que serán correlacionados y analizados.

Las dos pilas de imágenes deben tener tamaños de píxeles idénticos en todas las dimensiones y el mismo número de imágenes en cada pila. Establezca los umbrales para cada canal y siga las instrucciones en la interfaz del software, e ingrese los datos en el archivo de procesamiento de datos para su análisis. Esta figura muestra cómo la pila dual interpreta cuantitativamente la relación espacial entre bacterias y DBS.

En el interior del biofilm, Duo Stack calcula la distribución vertical de bacterias y EPS desde la superficie del disco hasta la fase fluida, como se observa aquí en la línea verde para bacterias y en la línea roja para EPS. Asimismo, calcula la colocalización de bacterias y EPS a través del grosor del biofilm. Como muestra la línea amarilla, los datos revelan proporciones más altas de EPS que de bacterias a lo largo de la profundidad del biofilm, y la mayoría de las células bacterianas están asociadas con EPS, especialmente desde las capas intermedias hacia arriba. Duo Stat, con representación 3D, proporciona una comprensión mejorada de la organización estructural y de las interacciones entre bacterias y EPS en los biofilms.

Para asegurar que se obtenga ARN de alta calidad a partir de biopelículas, recomendamos que la extracción de ARN se realice según el protocolo específico para biopelículas descrito en el artículo de Curian KU publicado en 2007. En la revista, se utilizan protocolos estándar de bioquímica analítica para la preparación de microarreglos de ADN y ensayos de PCR cuantitativa en tiempo real. Con el fin de facilitar el análisis de los grandes conjuntos de datos generados por experimentos de microarreglos, hemos diseñado un software para minería y organización de datos, el visualizador de datos de microarreglos o MDV, que está disponible en línea en www.oralgen.anl.gov.

Antes de enviar los datos a MDV, realice un análisis estadístico como una prueba T pareada con un modelo de varianza aleatoria utilizando el software BRB Array Tools disponible en línea, con un valor de corte de P de 0,001 para la comparación de clases. En este ejemplo, se realizó el análisis de biopelículas de S. mutans cultivadas en tres concentraciones distintas de azúcar y en cuatro puntos temporales. Se realizaron comparaciones pareadas, generando tres archivos BRB: condición A, 0,5 % de sacarosa más 1 % de almidón frente a 1 % de sacarosa; condición B, 0,5 % de sacarosa más 1 % de almidón frente a 0,5 % de sacarosa; y condición C, 0,5 % de sacarosa frente a 1 % de sacarosa.

Este panel representa el número de genes detectados como expresados diferencialmente en cada condición y punto temporal evaluado mediante la comparación estándar de clases utilizando la herramienta BRB Array, lo que resulta en un gran número de genes denominados datos brutos BRB. Para la demostración de MDV, nos centraremos en el punto temporal de 30 horas utilizando Excel. Convierta los datos brutos BRB en archivos de texto delimitados por tabulaciones para MDV.

Asegúrese de eliminar todas las letras que acompañan al número del tabulador del locus génico, por ejemplo, en el nombre SMU dot 1432 C. Elimine la letra C, abra MDV. Abra el menú de archivo y seleccione fuente de anotación. Elija la opción de archivo plano cuando aparezca un cuadro de diálogo.

Utilice los botones de navegación para seleccionar los archivos que contienen anotaciones para datos de clasificación funcional de vías por número de ontología genética y nombre de gen. Vaya al archivo e importe cada uno de los archivos convertidos al formato MDV. Cada archivo representa una condición experimental.

Compare los genes expresados en cada condición experimental A frente a B frente a C. En este ejemplo, utilizando la función de diagrama de Venn. Para esta demostración, nos centramos en los genes expresados diferencialmente que están relacionados exclusivamente con los efectos combinados de la sacarosa y el almidón. La función basada en el diagrama de Venn se utiliza para visualizar el número de genes únicos y compartidos expresados bajo estas diferentes condiciones y nos ayuda a identificar aquellos que se seleccionarán para un análisis posterior.

Aquí seleccionamos únicamente los genes expresados diferencialmente que son exclusivos de la condición A o B, pero no aquellos detectados en C, mostrados en gris como se indica. MDV redujo considerablemente el número total de genes a analizar y, al mismo tiempo, filtró los genes no relevantes para el caso experimental. En el menú de archivo, elija la opción de exportar para guardar los datos.

Como archivos separados por tabulaciones, los archivos pueden abrirse luego en Excel, donde se puede organizar la salida de datos y convertirla en las representaciones gráficas deseadas. La organización de los datos en Excel permite la visualización gráfica de la salida de MDV. Este gráfico muestra una visión general de la expresión diferencial de subconjuntos funcionales únicos de genes que se ven afectados por la combinación de almidón y sacarosa en etapas distintas del desarrollo del biofilm.

Las influencias en el transcriptoma de los mutantes S son más pronunciadas a las 30 horas de desarrollo del biofilm que en otros puntos temporales. Los resultados nos ayudaron a identificar con precisión subconjuntos funcionales específicos de genes que son relevantes para nuestra hipótesis de trabajo, considerando los efectos temporales que facilitaron la selección de genes y el proceso de validación posterior. Siguiendo este procedimiento, también se pueden realizar métodos bioquímicos y proteómicos para responder preguntas adicionales, como cuáles son las respuestas fisiológicas y metabólicas específicas de los organismos dentro de los biofilms.

Un análisis tan completo e integrado ciertamente ayudaría a comprender mejor cómo los biofilms modulan la patogenicidad en la cavidad oral, un entorno altamente dinámico y complejo. Para obtener más detalles, consulte el archivo PDF adjunto a este artículo de video.