Métodos para la transferencia rápida y localización de la enfermedad de Lyme patógenos en el intestino garrapatas
14 de febrero de 2011
Lyme estudios de investigación de la enfermedad a menudo requieren la generación de garrapatas infectadas con el patógeno Borrelia burgdorferi, un proceso que suele tardar varias semanas. Aquí se demuestra un procedimiento tick microinyección basado en una infección que se puede lograr en cuestión de horas. También demostramos un método de inmunofluorescencia para la localización in situ de B. burgdorferi en garrapatas.
El objetivo general de este procedimiento es microinyectar y localizar células de Borrelia bergdorferi en el intestino de la garrapata. Esto se logra primero preparando las agujas de capilar de vidrio y llenándolas con células de B. burgdorferi. A continuación, las células de B. burgdorferi se transfieren al intestino de la garrapata mediante microinyección.
A continuación, se disecciona la garrapata y se extraen los tejidos intestinales. Finalmente, se realiza la marcación por inmunofluorescencia de beberg defer en el intestino de la garrapata. En última instancia, se pueden obtener resultados que demuestran la localización de beberg en ferry en el intestino de la garrapata mediante microscopía confocal.
Hola, soy la doctora Ruth Paul Paul, profesora asistente en la Universidad de Maryland en el Departamento de Medicina Veterinaria. Hoy dos miembros de mi laboratorio, Toro Cairo, becaria postdoctoral, y Adam Coleman, estudiante de posgrado, les mostrarán el procedimiento para la infección artificial de garrapatas mediante microinyección que realizamos rutinariamente en el laboratorio. Después de la microinyección, disecaremos la garrapata e imaginaremos las bacterias en el intestino de la garrapata utilizando un microscopio confocal CE.
La principal ventaja de la microinyección en garrapatas para generar garrapatas naturalmente infectadas es la duración del procedimiento. La microinyección reduce todo el proceso de semanas a horas, ya que aproximadamente se requieren cinco semanas para obtener garrapatas infectadas mediante el proceso natural de alimentación. Esta técnica también puede adaptarse para inyectar otros reactivos útiles, como ARN bicatenario para interferencia por ARN (RNAi) o sueros antisueros para interferir con anticuerpos específicos dentro de la garrapata.
Para comenzar, fabrique varias agujas de microinyección calentando y tirando de tubos capilares de vidrio de un milímetro en un dispositivo para tirar de micropipetas de vidrio. Retire cuidadosamente los tubos capilares frágiles. Almacene las agujas reunidas con la punta hacia arriba sobre cinta adhesiva en una placa de Petri.
A continuación, cultive B. burgdorferi en medio BSK hasta alcanzar una concentración de aproximadamente 10⁷ células por mililitro. Pelletee B. burgdorferi mediante centrifugación a 3000 × g durante 10 minutos a temperatura ambiente. Retire el sobrenadante y resuspenda completamente el precipitado en medio BSK pasando suavemente a través de una micropunta estéril de 200 µL hasta alcanzar una concentración final de 10⁹ células por mililitro.
Dado que las células se resuspenden a alta densidad celular y podrían agruparse, la suspensión celular debe usarse inmediatamente para la microinyección para preparar las garrapatas; coloque cinta adhesiva transparente de doble cara sobre un portaobjetos trabajando sobre una superficie antideslizante, retire cuidadosamente las garrapatas del recipiente. Con un pincel pequeño, coloque el número requerido de garrapatas a inyectar sobre la cinta adhesiva con el lado ventral hacia arriba y orientadas en la misma dirección. Cargue cinco microlitros de la cultura de beberg de ferry en la aguja de capilar reunida. Utilizando una punta de pipeta de carga micro de 20 microlitros, inspeccione la aguja en busca de burbujas de aire atrapadas y recargue la aguja con la cultura bacteriana.
Si es necesario, observe la garrapata bajo el microscopio estereoscópico y enfoque el área del apéndice anal de la garrapata. Toque suavemente la punta de la aguja capilar para romper el tubo en el punto donde el diámetro es ligeramente más pequeño que el del apéndice anal de la garrapata, formando así la aguja de microinyección. Este paso es crítico, ya que cualquier intento de inyectar garrapatas con puntas de aguja inadecuadas provoca lesiones y posiblemente la muerte.
Al garrapato inyectado. Coloque las garrapatas inmovilizadas bajo el microscopio estereoscópico y enfoque en la abertura anal, que está cubierta por dos placas anales móviles. Utilizando pinzas finas, toque suavemente y aplique una presión muy leve en cualquier área cercana a la abertura anal.
Esto permitirá la separación de las placas anales y la apertura del poro anal que se conecta con el intestino. Inserte cuidadosamente la punta de la aguja ligeramente en la abertura anal a través de la separación forzada de las placas anales. La inserción de la aguja debe mantenerse al mínimo, ya que la punta de vidrio podría dañar el intestino posterior semitransparente que se conecta con el recto.
Utilizando un microinyector equipado con un control automático de pedal, inyecte la solución de ferry beberg utilizando los siguientes parámetros: presión de inyección de 1000 hectopascales, tiempo de inyección de 0,2 segundos y presión de compensación de ocho hectopascales. Cada garrapata recibe una única inyección tras la microinyección.
La garrapata debe mostrar signos de movimiento o arrastre en respuesta a estímulos similares a los previos a la inyección. Para diseccionar garrapatas para microscopía de inmunofluorescencia, primero coloque una gota de solución salina tamponada con fosfato sobre un portaobjetos limpio para la disección y otra sobre un portaobjetos recubierto con poli-L-lisina. Para microscopía, prepare otro portaobjetos con cinta adhesiva de doble cara. A continuación, retire la garrapata del recipiente y colóquela sobre la cinta adhesiva de doble cara.
Utilizando un pincel pequeño bajo la vista del microscopio de disección, enfoque en la garrapata y coloque una cuchilla de afeitar afilada sobre la garrapata entre el primer y segundo par de patas. Presione firmemente para cortar la garrapata en dos piezas, exponiendo el abdomen e inmediatamente sumerja el abdomen en una gota de PBS usando pinzas finas. Sujete el exoesqueleto dorsal y ventral alrededor del sitio del corte.
Extraiga cuidadosamente el escudo dorsal hacia arriba y alejándolo de la garrapata, exponiendo así el divertículo intestinal de color marronáceo. Tenga cuidado de mantener las garrapatas en diseción bajo PBS en todo momento. Los haces de glándulas salivales semitranslúcidas se encuentran a ambos lados de la región anterior del intestino y pueden retirarse en este momento si se desea.
Sujetando el exoesqueleto restante en su lugar con pinzas, extraiga cuidadosamente el intestino del abdomen. Limpie cuidadosamente el intestino eliminando cualquier tejido atrapado, como la tráquea. Usando la punta de unas pinzas finas, transfiera rápidamente el intestino de la garrapata a una gota de PBS sobre un portaobjetos de vidrio con poli-L-lisina.
Divida el intestino en fragmentos más pequeños utilizando hojas finas o presionando suavemente con la punta de pinzas finas. Aspire cuidadosamente el exceso de PBS alrededor de los tejidos intestinales. Deje secar al aire los tejidos intestinales a temperatura ambiente.
Fije el intestino de la garrapata sumergiéndolo en acetona durante 10 minutos. Deje secar al aire a temperatura ambiente; los portaobjetos pueden almacenarse en este paso durante meses a menos 20 grados Celsius en un recipiente hermético. Para la marcación inmunofluorescente del intestino, dibuje un círculo alrededor del intestino de la garrapata fijado con un lápiz Pap o cualquier otro dispositivo que cree una barrera hidrófoba.
Esto ayudará a retener las soluciones de tinción durante los pasos posteriores de incubación. Cubra el intestino de la garrapata con una o varias gotas de tampón bloqueador durante 30 minutos. A temperatura ambiente.
El suero utilizado para el bloqueo depende del origen del animal hospedador del anticuerpo. No permita que la laminilla se seque a partir de este momento. Aspire lentamente el tampón de bloqueo.
Incube el intestino con soluciones apropiadas de anticuerpos primarios y/o secundarios. Utilizamos fluoresceína, isotiocianato o FXI marcado anti B berg. Incube el anticuerpo a una dilución de uno a 100 en tampón bloqueante durante una hora.
A temperatura ambiente, cubra el recipiente con papel de aluminio para limitar la exposición a la luz. Retire la solución de anticuerpo mediante aspiración suave. Incube el intestino con un colorante fluorescente para etiquetar los tejidos de la garrapata, como DPI o yoduro de propidio.
Normalmente utilizamos 20 microgramos por mililitro de yoduro de peridinio en PBS durante cinco minutos a temperatura ambiente, lavamos tres veces con tween 20 al 0,05 % en PBS durante cinco minutos. Finalmente, montamos la preparación en glicerol tamponado que contiene un reactivo Antifa y cubrimos cuidadosamente con un cubreobjetos de vidrio. Las preparaciones pueden almacenarse en este paso durante varios meses a cuatro grados Celsius en un recipiente hermético, e imaginar y localizar b berg de ferry mediante un microscopio confocal.
Se muestra aquí una microinyección en una garrapata con una aguja llena de azul brillante kumasi para hacerla visible. Se utilizan pinzas finas para aplicar una presión suave sobre el cuerpo, lo que permite la separación de las placas anales y la apertura del poro anal para la microinyección. Aquí, se muestra la región anterior de un divertículo intestinal con beberg ferry dentro del intestino.
Los núcleos intestinales y las espiroquetas se marcan con yoduro de propidio o con anti beberg ferry conjugado con fitzy, respectivamente. Una vez dominada la técnica, hemos encontrado que se pueden microinyectar 10 garrapatas, con alrededor de cien mil que sobreviven e infectan naturalmente con fer. Aunque las garrapatas pueden usarse inmediatamente para otros experimentos, generalmente esperamos uno o dos días para asegurarnos de que las garrapatas sobrevivan al procedimiento antes de continuar.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar garrapatas artificialmente infectadas mediante microinyección y barrera localizada de microorganismos dentro del intestino de la garrapata utilizando inmunomarcado con microscopía confocal. Trabajar con garrapatas y finas agujas de vidrio cargadas con un patógeno humano, como Borrelia burgdorferi, puede ser peligroso durante el procedimiento. Tenga en cuenta en todo momento la ubicación de las garrapatas y las agujas, y siga en todo momento las precauciones de nivel de bioseguridad dos.
Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.
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Descripción general
Este estudio presenta un método basado en microinyección para infectar garrapatas con Borrelia burgdorferi, reduciendo significativamente el tiempo necesario para la infección de las garrapatas. Además, se demuestra una técnica de inmunofluorescencia para localizar el patógeno dentro de los tejidos de las garrapatas.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Microbiología
- Biología de vectores
- Localización de patógenos
Antecedentes
- La enfermedad de Lyme es causada por la bacteria Borrelia burgdorferi.
- Las garrapatas son los vectores principales para la transmisión de este patógeno.
- Los métodos tradicionales para infectar garrapatas son lentos.
- Los métodos de infección rápida pueden mejorar la eficiencia de la investigación.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método más rápido para infectar garrapatas con B. burgdorferi.
- Permitir la localización in situ del patógeno en los tejidos de las garrapatas.
- Mejorar la comprensión de las interacciones entre garrapatas y patógenos.
Métodos Utilizados
- Preparación de agujas de capilar de vidrio para microinyección.
- Microinyección de células de B. burgdorferi en el intestino de la garrapata.
- Diseción de garrapatas para aislar los tejidos intestinales.
- Etiquetado por inmunofluorescencia de B. burgdorferi en tejidos intestinales.
Resultados principales
- Microinyección exitosa de B. burgdorferi en los intestinos de las garrapatas.
- Localización eficaz del patógeno demostrada mediante inmunofluorescencia.
- Resultados visualizados utilizando microscopía confocal.
- El método reduce significativamente el tiempo necesario para la infección de las garrapatas.
Conclusiones
- La técnica de microinyección es una alternativa viable para la infección de garrapatas.
- La inmunofluorescencia permite la localización precisa de patógenos.
- Este enfoque puede facilitar investigaciones adicionales sobre la transmisión de la enfermedad de Lyme.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La infección rápida y controlada de vectores de garrapatas con Borrelia burgdorferi permite un estudio eficiente de las interacciones patógeno-vector, fundamentales para la investigación de la enfermedad de Lyme. Este enfoque de microinyección reduce los tiempos de infección de semanas a horas, facilitando el cribado de alto rendimiento y la reducción mecanicista de riesgos en las fases iniciales del descubrimiento. El método proporciona una entrega reproducible del patógeno, mejorando la confianza predictiva en las validaciones de dianas y en los flujos de trabajo de desarrollo de ensayos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar las interacciones entre Borrelia burgdorferi y el intestino del garrapato para validar dianas terapéuticas implicadas en la persistencia y transmisión del patógeno.
- Valor operativo: Proporciona cargas estandarizadas de patógenos en cohortes de garrapatos, reduciendo la variabilidad en los modelos de infección y mejorando la reproducibilidad de los ensayos.
- Valor predictivo: Facilita la desvinculación funcional de dianas al permitir una exposición controlada a cepas de patógenos, incluidas aquellas atenuadas en modelos murinos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Genera tejidos de garrapatas infectadas adecuados para ensayos posteriores de inmunofluorescencia y microscopía confocal para cuantificar la localización y la carga del patógeno.
- Valor operativo: Produce resultados cuantificables y listos para microscopía que permiten la estandarización de las lecturas de detección de patógenos en campañas de cribado.
- Escalabilidad: Facilita la preparación de un gran número de garrapatas uniformemente infectadas, lo que favorece la reproducibilidad del ensayo y el reutilización de la plataforma en sistemas de cribado basados en vectores.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Continuidad Translacional: Proporciona un sistema relevante para la enfermedad que permite estudiar la localización de Borrelia burgdorferi en el intestino de la garrapata, conectando hallazgos in vitro con la fisiopatología basada en vectores.
- Reducción Mecanicista de Riesgos: Permite visualizar la distribución del patógeno dentro de los tejidos de la garrapata, aportando información para formular hipótesis sobre factores de virulencia específicos de cada tejido y mecanismos de transmisión.
- Perfeccionamiento del Modelo Preclínico: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo al proporcionar una exposición constante al patógeno para evaluar la eficacia de intervenciones en modelos de enfermedades transmitidas por garrapatas.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la evaluación preclínica, permitiendo la generación rápida de vectores de garrapatas infectadas y lecturas estandarizadas de la localización del patógeno.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre las interacciones patógeno-vector mediante la administración de cantidades controladas de Borrelia burgdorferi al intestino de la garrapata para su análisis mecanicista.
- Selección: Produce tejidos de garrapatas infectados y estandarizados, adecuados para ensayos cuantitativos de inmunofluorescencia, mejorando la reproducibilidad en los protocolos de detección de patógenos.
- Análisis: Genera lecturas basadas en microscopía confocal de la localización y carga del patógeno, permitiendo análisis comparativos entre diferentes condiciones experimentales e intervenciones.
- Investigación Traducional: Conecta el cultivo in vitro de patógenos con la localización en tejidos de garrapatas, favoreciendo la alineación de biomarcadores y la relevancia fisiopatológica en modelos de enfermedades transmitidas por vectores.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para infectar garrapatas con diversos agentes biológicos, incluyendo anticuerpos y reactivos de ARNi, ampliando su utilidad más allá de los estudios con Borrelia burgdorferi.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en la validación de objetivos al reducir la ambigüedad mecanicista en las interacciones patógeno-vector mediante la detección localizada del patógeno.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y escalabilidad de los modelos de infección en garrapatas, reduciendo el tiempo y la inversión de recursos en comparación con los métodos de alimentación natural.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia en las decisiones de avance o interrupción en las fases iniciales del descubrimiento al proporcionar modelos estandarizados y rápidos de exposición al patógeno para la reducción de riesgos del objetivo.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de iniciativas de investigación sobre la enfermedad de Lyme mediante modelos de infección fiables y de alta fidelidad que reducen la variabilidad biológica.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de microinyección, manipulación de garrapatas y microscopía confocal de inmunofluorescencia.
- Depende de la preparación de agujas de capilar de vidrio, instrumentación de microinyector e infraestructura para microscopía de fluorescencia.
- Necesita la estandarización de los parámetros de inyección y de los protocolos de disección intestinal entre los equipos, para garantizar una administración del patógeno y lecturas de localización consistentes.
- La adaptación a diferentes especies de garrapatas o cepas de patógenos puede requerir la optimización del tamaño de la aguja, la presión de inyección y la concentración bacteriana.
- Las limitaciones prácticas incluyen la habilidad técnica necesaria para realizar con éxito la microinyección y la disección intestinal, así como la necesidad de contención en nivel de bioseguridad dos al manipular patógenos humanos.
