Glicol eficiente de polietileno (PEG) de la transformación mediada por Moss Physcomitrella patens
19 de abril de 2011
Un método simple y eficiente para transformar Physcomitrella pantens Protoplastos se describe. Este método es una adaptación de los protocolos para Physocmitrella Protonemal protoplastos y Arabidopsis Mesófilo de transformación de protoplastos 1.
El objetivo general de este procedimiento es transformar protoplastos de SCO Metre. Esto se logra primero digiriendo las plantas con Drizly. A continuación, los protoplastos se lavan con manitol para eliminar el Drizly y luego se incuban con ADN y PEG.
Finalmente, los protoplastos transformados se siembran en placas e incubarán. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren protoplastos transformados expresando proteínas marcadas con fluorescencia mediante microscopía de fluorescencia. Quien demostrará el procedimiento será Y. Lu, un posdoctorado de mi laboratorio.
La principal ventaja de esta técnica es que es eficaz y genera de forma constante protoplastos que expresan la proteína de interés. Para aislar protoplastos de musgo, comience añadiendo nueve mililitros de manitol al 8 % en una placa de Petri utilizando una espátula. Coloque musgo de cinco a siete días de edad procedente de dos o tres placas PP NH cuatro en el manitol. Consulte el protocolo escrito adjunto para este y otros preparados de reactivos. A continuación, añada tres mililitros de Drizly al 2 % e incube a temperatura ambiente con agitación suave durante una hora.
Filtre la mezcla a través de una malla de 100 micrones para obtener una suspensión homogénea verde. Luego, centrifugue el filtrado a 250 G durante cinco minutos. Descarte el sobrenadante con mucho cuidado.
ReSuspender los protoplastos en 500 microlitros de manitol al 8%. Luego, añadir 9,5 mililitros adicionales de manitol al 8%. Asegurarse de que los protoplastos queden completamente suspendidos.
Realice los pasos de lavado otras dos veces, centrifugando nuevamente la solución a 250 G durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y resuspenda los protoplastos primero en 500 microlitros.
Luego, 9,5 mililitros de manitol al 8 % utilizando un hemocitómetro. Cuente el número de protoplastos en 10 microlitros de la suspensión para transformar el ADN en los protoplastos aislados. Primero, centrifugue la mezcla de protoplastos a 250 G durante cinco minutos.
Retire el sobrenadante y resuspenda los protoplastos a 1,6 millones por mililitro en solución MMG. Incube la suspensión a temperatura ambiente durante 20 minutos. A continuación, agregue 600 microlitros de la solución de protoplastos a un tubo de cultivo que contenga 60 microgramos de ADN. Agite.
Añada suavemente 700 microlitros de solución de PEG con calcio y agite. Incube adecuadamente la muestra a temperatura ambiente durante 30 minutos en este período de espera. Cubra las placas PRMB con papel de celofán.
Luego, diluya la suspensión con tres mililitros de solución W5 y centrifugue a 250 ×g durante cinco minutos. Para eliminar el PEG, re suspenda los protoplastos en dos mililitros de medio PRMT y plaque un mililitro por placa PRMB recubierta con celofán. Mantenga las placas a 25 grados Celsius en una cámara de crecimiento.
Finalmente, cuatro días después de la transformación, transfiera el celofán a placas de selección frescas. Esta figura muestra un ejemplo de plantas de 18 días de edad regeneradas a partir de protoplastos, transformados con 15 microgramos de ADN plasmídico superenrollado, que portan un casete de resistencia a higromicina. Aquí, 30 microgramos del mismo plásmido superenrollado, ADN, fueron transformados en protoplastos.
Se transformaron 60 microgramos de ADN de tipo plásmido en esta muestra. Y finalmente, estas plantas se regeneraron a partir de protoplastos que fueron transformados con 120 microgramos del mismo ADN plasmidial superenrollado que portaba el casete de resistencia a higromicina. La eficiencia de transformación no se ve afectada por concentraciones de ADN de hasta 60 microgramos.
Sin embargo, concentraciones más altas de ADN son perjudiciales para este procedimiento. Los datos indican que este método proporciona resultados consistentes en un amplio rango de cantidades de ADN Una vez por semestre. Esta técnica puede realizarse en tres horas si se lleva a cabo correctamente.
Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar métodos adicionales como el ARNi transitorio y las eliminaciones génicas para responder preguntas adicionales sobre la función génica.
Descripción general
Este artículo describe un método sencillo y eficiente para transformar protoplastos de Physcomitrella patens. La técnica se adapta de protocolos existentes para la transformación de protoplastos y tiene como objetivo producir resultados exitosos de forma consistente.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología vegetal
- Ingeniería genética
- Biología celular
Antecedentes
- Los protoplastos son células vegetales a las que se les ha eliminado la pared celular.
- Las técnicas de transformación son esenciales para estudiar la función génica en plantas.
- Physcomitrella patens sirve como organismo modelo en la investigación vegetal.
- Los métodos existentes para la transformación de protoplastos pueden ser complejos y requieren mucho tiempo.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un protocolo optimizado para la transformación de protoplastos de Physcomitrella patens.
- Mejorar la eficiencia y fiabilidad de la transformación de protoplastos.
- Facilitar estudios genéticos adicionales en musgos.
Métodos Utilizados
- Digerir tejido de musgo con Drizly para aislar protoplastos.
- Lavar los protoplastos con manitol para eliminar contaminantes.
- Transformar protoplastos aislados con ADN utilizando PEG.
- Incubar protoplastos transformados en medio selectivo.
Resultados principales
- Los protoplastos transformados expresaron con éxito proteínas fluorescentes.
- El método mostró una eficiencia de transformación constante en diversas concentraciones de ADN.
- Se encontró que concentraciones más altas de ADN eran perjudiciales para el éxito de la transformación.
- Todo el procedimiento puede completarse en aproximadamente tres horas.
Conclusiones
- Este método proporciona un enfoque confiable para transformar protoplastos de Physcomitrella patens.
- Permite realizar experimentos posteriores, como ARNip transitorios y eliminaciones génicas.
- El protocolo puede contribuir significativamente a comprender la función génica en musgos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La transformación mediada por PEG de protoplastos de Physcomitrella patens permite una entrega eficiente y reproducible de genes, favoreciendo la genómica funcional de alto rendimiento en sistemas vegetales. Esta capacidad es fundamental para equipos de descubrimiento temprano que buscan investigar la función génica, validar dianas y acelerar la elucidación de vías en un modelo genéticamente manejable. La escalabilidad del método y su potencial de estandarización lo convierten en una herramienta valiosa para cribados genéticos a escala de cartera y para la reducción de riesgos mecanicistas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite la interrogación rápida de la función génica mediante la entrega eficiente de ADN a células de musgo.
- Apoya la localización génica de alta frecuencia para la validación funcional de objetivos y el análisis de vías.
- Facilita la reducción mecanicista de riesgos al permitir modificaciones genéticas precisas en un sistema modelo.
- Mejora la confianza predictiva para hipótesis biológicas posteriores.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Proporciona un protocolo estandarizado para generar grandes cantidades de transformantes para ensayos de cribado.
- Ofrece una eficiencia de transformación reproducible, lo que respalda la fiabilidad y escalabilidad del ensayo.
- Permite la preparación de sistemas biológicos validados para la evaluación de compuestos y cribado fenotípico.
- Reduce la dependencia de equipos especializados, aumentando la accesibilidad para los equipos de desarrollo de ensayos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Permite aplicaciones posteriores, como estudios de interferencia transitoria de ARN y eliminación génica, relevantes para la modelización de enfermedades.
- Facilita la continuidad desde el descubrimiento génico hasta la validación preclínica en sistemas basados en plantas.
- Ofrece una plataforma para la exploración traslacional de biomarcadores cuando se alinea con vías relevantes para enfermedades.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este protocolo de transformación se enmarca dentro del continuo de descubrimiento inicial hasta la identificación del candidato principal, permitiendo la manipulación genética, la validación de dianas y el desarrollo de ensayos en modelos vegetales.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías mediante la entrega eficiente de genes y el análisis de expresión.
- Selección: Asegura la preparación y reproducibilidad de ensayos mediante la generación de poblaciones de transformantes consistentes.
- Análisis: Proporciona resultados cuantitativos como la eficiencia de transformación y la expresión proteica para análisis comparativo.
- Investigación Traducional: Permite estudios genéticos que contribuyen al desarrollo de modelos preclínicos y a la identificación de biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Ofrece una capacidad de transformación estandarizada y ampliamente aplicable para diversos estudios genéticos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en los estudios de función génica.
- Valor operativo: Proporciona estandarización, reproducibilidad y escalabilidad para los flujos de trabajo de transformación genética.
- Valor estratégico: Mejora la toma de decisiones de avance o interrupción y la eficiencia del capital al permitir la generación robusta de datos en etapas tempranas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo y el avance de dianas y vías genéticas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo celular vegetal y técnica estéril para el aislamiento y transformación de protoplastos.
- Necesita acceso a infraestructura básica de laboratorio, incluyendo centrifugación y microscopía de fluorescencia para la validación de resultados.
- Exige estandarización entre equipos de los parámetros de transformación para garantizar la reproducibilidad entre proyectos.
- Puede requerir adaptación para su uso en otras especies vegetales o sistemas modelo distintos de Physcomitrella patens.
- La eficiencia de transformación es sensible a la concentración de ADN, siendo potencialmente perjudiciales cantidades más altas.
