El análisis de microarrays para Saccharomyces cerevisiae

El objetivo general de este procedimiento es introducir a los estudiantes universitarios de ciencias en la tecnología de microarreglos mediante el análisis de las diferencias de expresión en levaduras sometidas a estrés oxidativo. Esto se logra primero aislado ARN total de cultivos de levadura tratados con peróxido de hidrógeno y de los controles no tratados. El segundo paso del procedimiento consiste en generar y purificar ADNc a partir de estas muestras de ARN.

El ADNc se utiliza entonces para preparar ARNc marcado con biotina mediante transcripción in vitro. El paso final del procedimiento es la fragmentación de los ARNc marcados con biotina para hibridación con los chips génicos de levadura AFI metrics. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran las diferencias de expresión en las dos muestras de levadura y que, mediante bioinformática, demuestran el poder del análisis de microarreglos a estudiantes universitarios.

El equipo de divulgación de la Vermont Genetics Network tuvo por primera vez la idea de este método cuando se le encargó ofrecer la tecnología de microrrayos a estudiantes de ciencias en todo el estado de Vermont con el fin de mejorar su educación científica. Hasta la fecha, este método se ha impartido en múltiples sedes de ocho colegios universitarios en todo el estado. Así, la principal ventaja del uso de microrrayos en módulos de enseñanza es que nos brinda la capacidad de enseñar técnicas generales de biología molecular utilizadas a diario en el laboratorio a un grupo de personas.

Y también aprovechamos esto para enseñar tanto a estudiantes como a profesores y a nuestros grupos. De hecho, tenemos estudiantes y profesores trabajando juntos en el mismo proyecto. Aprenden ciertas técnicas que requieren mucha destreza, como el manejo de ARN, que no es una tarea sencilla.

Aprenden cómo precipitar el ADN utilizando reactivos de visualización. En realidad, llegan a utilizar las técnicas que encontrarán en estudios de posgrado o en laboratorios de biología molecular cotidianos. Aunque este método es adecuado para obtener conocimientos sobre el estrés oxidativo y la levadura, ciertamente es aplicable a otros organismos modelo y otros sistemas biológicos que ustedes deseen analizar.

Los cambios en la expresión génica, ya sea que estén asociados con cambios en el desarrollo, toxinas ambientales, estados específicos de enfermedad, y realmente muchos más. Para examinar las diferencias de expresión en levaduras sometidas a estrés oxidativo, primero se extrae ARN total de dos cultivos de levadura mediante lisis enzimática. Un cultivo fue expuesto a estrés oxidativo mediante un tratamiento de una hora con peróxido de hidrógeno 0,5 milimolar en solución salina tamponada con Hank, mientras que el otro cultivo fue tratado únicamente con HBSS como control.

Comience etiquetando dos tubos microcentrífugos de 1,7 mililitros con la información de identificación correspondiente. Transfiera 1,5 mililitros de la cultura de levadura adecuada a cada tubo. Centrifugue los tubos a 5.000 G durante dos minutos a temperatura ambiente.

Después de la centrifugación, utilice una micropipeta para retirar y desechar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el precipitado. Verifique que el precipitado sea lo suficientemente grande antes de continuar con el procedimiento. Si el precipitado es demasiado pequeño, agregue 1,5 mililitros de cultivo al mismo tubo que contiene el precipitado y luego centrifugue para obtener un precipitado mayor.

Descarte el sobrenadante con una pipeta microlitros, eliminando la mayor cantidad posible de líquido del sedimento de levaduras. A continuación, agregue 100 microlitros de tampón SG y 30 microlitros de solución de liasa al sedimento de levaduras y vortexee para mezclar. Incube ambos tubos durante 30 minutos a temperatura ambiente durante la incubación.

Agite suavemente cada tubo cada 10 minutos para generar platos. Uno de los pasos más críticos al realizar el plaqueo esférico de levaduras es asegurarse de que realmente se haya creado un 100 % de plástico esférico tras el tratamiento. Esto significa que no todas las enzimas líticas son iguales.

Por lo tanto, debe verificar que la buena enzima lítica le esté proporcionando una buena esferoplastia, lo que significa que debe tomar estas muestras, colocarlas sobre un portaobjetos y observarlas al microscopio tras añadir SDS al 0,1 % para asegurarse de que se esté formando protoplastos. Para observar una esferoplastia completa, aspire 10 microlitros de la muestra de levadura y colóquela sobre un portaobjetos, examinando la muestra al microscopio con un microlitro de SDS al 0,1 %, lo que hará que las células de levadura se hinchen y formen esferas o esferoides perfectos. Es importante observar que las células en gemación también formen esferoides en forma de S.

Si se observa un plaqueo esférico parcial, se recomienda un tratamiento prolongado con liasa. Una vez que se haya confirmado el plaqueo esférico completo, añada 350 microlitros de tampón BRLT a cada tubo, seguido de 250 microlitros de etanol al 100 %. Asegúrese de que el tubo esté bien cerrado sujetando la tapa y vortexee vigorosamente durante un minuto.

Este procedimiento lisará las placas Sphero. Después de esto, utilice columnas Easy Z-spin y R para recolectar y purificar el ARN de los dos cultivos. Finalmente, evalúe la calidad del ARN extraído mediante un gel de agarosa precolado al 1,2 % para electroforesis, con el fin de preparar ARNc marcado con biotina.

El ARN total extraído de las células de levadura se utiliza primero para sintetizar ADNc mediante transcripción inversa. Después de la generación de ADNc, prepare tubos con gel de bloqueo de fases para su uso en la precipitación de ADNc; centrifugue los tubos con gel de bloqueo de fases a velocidad máxima durante un minuto para asegurar que el gel esté en la parte inferior del tubo. No vortex los tubos con gel de bloqueo para precipitar el ADNc; pipetee 162 microlitros de la capa inferior de una mezcla de fenol clorofórmico tamponado con tris a pH 8,0, alcohol isoamílico, o mezcla PCI, y añádalo al contenido de 162 microlitros del tubo de reacción de síntesis de la segunda cadena de ADNc. Se requieren volúmenes iguales de mezclas acuosas y orgánicas para este paso.

Vortex durante cinco segundos para mezclar el contenido. A continuación, utilice una micropipeta para transferir toda la mezcla de CD N-A-P-C-I al tubo con gel de bloqueo de fases. No vortex el tubo con gel de bloqueo de fases; centrifugue a velocidad máxima durante dos minutos.

Luego, utilice una micropipeta para transferir la capa superior desde el tubo de gel de bloqueo de fases a un tubo nuevo etiquetado de 1,7 mililitros. Intente recolectar la mayor cantidad posible de la capa. Añada lo siguiente al tubo microcentrífugo de 1,7 mililitros: 405 microlitros de etanol al 100 %, 80 microlitros de acetato de amonio y un microlitro de vortex de pintura de pellet.

Coloque brevemente el tubo en la centrífuga con la bisagra del tubo orientada hacia afuera y centrifugue a velocidad máxima durante 20 minutos. Cuando finalice la centrifugación, a temperatura ambiente, retire suavemente el tubo de la centrífuga teniendo cuidado de no perturbar el pellet de ADN. El pellet debe ser de color rosa debido al colorante y tener aproximadamente el tamaño de un grano de sal.

Y en el lateral del tubo debajo de la bisagra, coloque el pellet de ADN en hielo y proceda inmediatamente a la limpieza del pellet. Para comenzar el procedimiento de limpieza del pellet de ADN, utilice una micropipeta P1000 para retirar cuidadosamente todo el sobrenadante del tubo. Tenga cuidado de no perturbar el pellet.

Coloque su muestra de 500 microlitros de etanol frío al 80 % en el tubo. Tape suavemente el tubo e inviértalo lentamente varias veces. Observe atentamente su pellet para asegurarse de que no se desprenda de la pared del tubo.

Si el precipitado se desprende, puede hacer que vuelva al fondo del tubo colocando nuevamente el tubo en la gradilla y dejando que el precipitado se asiente en el fondo, o centrifugando el tubo a máxima velocidad durante 15 segundos. A continuación, utilice una micropipeta P1000 para retirar cuidadosamente el etanol sin perturbar el precipitado. Incline el tubo para permitir la eliminación de la mayor cantidad posible de líquido.

Añada una nueva Eloqua de etanol frío al 80 %, tape el tubo e inviértalo lentamente varias veces. Después de eliminar todo el etanol posible utilizando una micropipeta P1000, centrifugue el tubo a velocidad máxima durante cinco segundos.

Luego, utilice una micropipeta P10 para eliminar los últimos microlitros de etanol sin perturbar el precipitado. Coloque el tubo abierto en una caja de secado durante 10 a 20 minutos para evaporar el etanol restante. El precipitado se puede perder fácilmente una vez que esté seco, así que tenga cuidado de manipular el tubo suavemente y de cerrar la tapa.

Una vez finalizado el secado, visualice el pellet seco para confirmar su presencia en el tubo. Finalmente, resuspenda el pellet seco en 22 microlitros de agua libre de ARN y coloque el tubo en hielo. Este ADNc se utiliza entonces para preparar ARNc marcado con biotina mediante transcripción in vitro usando el kit Enzo BioArray.

Después de que el ARNc marcado con biotina haya sido purificado y cuantificado, se fragmenta para la preparación del blanco. Una vez que se ha generado el ADNc, utilizamos la metodología estándar de transcripción in vitro para generar ARNc biotinilado. El ARNc debe someterse a fragmentación antes de poder aplicarse al chip de microarreglo.

Para comenzar este procedimiento, transfiera una cantidad equivalente a cinco microgramos de ARNc a un tubo PCR de 0,5 mililitros etiquetado. Añada suficiente agua libre de ARNasas para llevar el volumen total a 16 microlitros, y luego agregue cuatro microlitros de tampón de fragmentación 5x al tubo. El volumen total en el tubo debe ser de 20 microlitros.

Vortex la tubo y centrifugue durante 10 segundos. Luego incube el tubo a 94 grados Celsius durante 30 minutos. En un termociclador, coloque el tubo sobre hielo tras la incubación.

El ARNc fragmentado y no fragmentado de cada muestra se evalúa luego mediante electroforesis utilizando un gel AROS precolado al 1,2 %. Cuando finaliza la corrida, el gel se visualiza en un transiluminador y se adquiere una imagen. El producto final de síntesis se hibrida con microchips génicos de levadura atric, y aquí se muestran resultados representativos del análisis de microarreglo.

Esta primera figura es un ejemplo de una imagen escaneada de un microarreglo génico de levadura atrics, generada por el software operativo del microarreglo génico atrics. Se trata de un diagrama de dispersión bidimensional de todos los transcritos genéticos, aproximadamente 6 700 genes, que compara los datos de levadura control y tratada. Cada punto representa un gen individual.

Los genes coloreados en morado indican genes que se expresan de manera diferencial, mientras que los genes coloreados en rojo no lo son. En este ejemplo, la mayoría de los genes expresados de manera diferencial son aquellos implicados en el control del ciclo celular, según lo indicado por sus descripciones. Este diagrama de flujo procedente de la base de datos para la visualización de anotaciones y el descubrimiento integrado ilustra los genes expresados de manera diferencial en una vía biológica afectada.

Los genes indicados con una estrella roja indican los genes regulados a la baja en la vía mitótica. Finalmente, aquí se muestran resultados representativos de un gráfico de volcan plot generado mediante el software Geo Species Gene Sifter. Se compararon muestras control y tratadas con un valor de P de corte de 0,05 y un cambio en la expresión de 1,5 veces.

Optamos por utilizar levadura porque es fácil de cultivar rápidamente, pero también comprendimos que la parte más crítica del trabajo con levaduras es, en realidad, la creación de una esferoplastación adecuada. Una de las cosas que no deseamos hacer en una microarreglo es realizar una digestión incompleta y, en consecuencia, esferoplastar únicamente células que se encuentren en una fase G1 o en una fase G2/M. De lo contrario, estaríamos realizando un experimento de microarreglo con levaduras que se hallan en una fase específica de replicación.

Otro punto complicado que intentamos destacar en este ejercicio es que la precipitación del ADN, de la que la gente habla a diario, no es necesariamente fácil. Y lo que hemos hecho en nuestro módulo es utilizar en realidad tubos especializados y reactivos de visualización. Así podemos centrifugar el ADN y visualizar el sedimento, lo que facilita la tarea tanto para estudiantes como para profesores.

De modo que puede utilizarse en todas las fases del trabajo con ADN y ARN tras su desarrollo. Este módulo ha allanado realmente el camino para que los profesores de institutos con programas de licenciatura exploren, posiblemente, otros organismos modelo u otros regímenes de tratamiento que podrían ser compatibles con los planes de estudio existentes o con sus propios intereses de investigación. Y para darles un ejemplo de algunas de las modificaciones realizadas, hubo un sitio que estudió los efectos del tratamiento con herbicida en levadura, otro que analizó el tratamiento con LAMP IDE en levadura, mientras que otro sitio examinó los cambios del desarrollo en una línea celular de mamífero que les interesaba particularmente.

Y por último, otro sitio había analizado el impacto de diferentes fuentes de luz sobre Arabidopsis u otras plantas. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo configurar un experimento de microrrayos con estudiantes universitarios de ciencias, incluyendo el aislamiento de ARN total de levadura, la generación de ADNc y la fragmentación de ARNc marcado con biotina. Las experiencias prácticas con tecnologías de este nivel ayudan a reforzar y fortalecer la educación científica universitaria.