Fabricación de un dispositivo de microfluidos para la compartimentación de las neuronas y los axones Soma

Bienvenido al laboratorio del Dr. Newly John. El Laboratorio John se especializa en el diseño de plataformas microfluídicas para aplicaciones biológicas. En este video, demostraremos la producción y utilización de un dispositivo microfluídico diseñado para la compartimentalización y el cultivo de neuronas primarias.

El dispositivo neuronal fue publicado por primera vez en Nature Methods en agosto de 2005. Desde su introducción, el dispositivo neuronal ha sido ampliamente utilizado por colaboradores de todo el mundo. El dispositivo neuronal consiste en un trozo de PDMS que ha sido moldeado sobre una oblea de silicio que contiene un patrón SUA del dispositivo, creado previamente mediante fotolitografía.

El dispositivo tiene tres características principales, cuatro depósitos, de ocho milímetros de diámetro, dos canales principales de 1,5 milímetros de ancho cada uno, siete milímetros de largo y cien micrones de altura, y microsurcos, que tienen 10 micrómetros de ancho y tres micrómetros de altura, y que conectan los dos canales principales. Los microsurcos pueden variar en longitud desde 150 micrones hasta 900 micrones, aunque la longitud estándar elegida es de 450 micrones. Al observar el dispositivo de manera que los canales principales y los microsurcos estén en posición vertical, podemos ver que los depósitos situados a la izquierda de los surcos están conectados a través de los canales principales, al igual que los depósitos situados a la derecha.

Esta característica permite que el líquido fluya a través del canal principal, lo cual es fundamental para cargar células y cambiar los medios. El dispositivo neuronal presenta tres ventajas principales frente a las plataformas tradicionales de cultivo celular. Primero, permite la compartimentalización separada de los cuerpos celulares o soma y los axones. Con el dispositivo neuronal, es posible obtener fracciones axonales puras.

El tamaño y la longitud de las microestrías permiten que los axones atraviesen el otro canal principal, al tiempo que impiden que los cuerpos celulares crucen. En segundo lugar, debido al diseño del dispositivo y aprovechando la presión hidrostática, es posible someter independientemente el lado celular y/o el lado axonal del dispositivo a tratamientos separados, simplemente manteniendo el volumen y los depósitos más altos en un lado del dispositivo en comparación con el otro. Y en tercer lugar, la fracción pura de axones del dispositivo puede seccionarse mediante succión al vacío, lo que permite al investigador estudiar y observar la regeneración axonal.

La investigadora Hina Lee demostrará ahora cómo preparar el dispositivo microfluídico de neuronas. Se utiliza un oblea de silicio de tres ángstrom con un patrón fabricado en SU-8 mediante fotolitografía para moldear el molde microfluídico de PDMS (poli(dimetilsiloxano)). Nos referimos a la oblea de silicio con patrón de SU-8 como moldes maestros o simplemente masters.

El PDMS se mezcla con agente de curado en una proporción de peso a peso de 10 a 1. Es decir, por ejemplo, 15 gramos de PDMS por 1,5 gramos de agente de curado. Luego, el PDMS se mezcla bien y se vierte sobre la oblea de silicio.

La oblea de silicio está contenida dentro de una placa de Petri de poliestireno de 10 centímetros. Se necesitan aproximadamente entre 12 gramos y 15 gramos de PDMS para cubrir los MA con un espesor de aproximadamente cuatro milímetros. Luego, el molde con el PDMS se coloca en un desecador al vacío con la tapa de la placa de Petri retirada y se aplica vacío.

Esto se hace para ayudar a eliminar las burbujas de aire del PDMS que se introdujeron durante la agitación del agente de curado. Tarda aproximadamente 15 minutos en eliminarse las burbujas de aire. La matriz con PDMS se retira del desecador después de 15 minutos en el desecador al vacío.

Aún quedan algunas burbujas en el molde maestro de PDMS. Se utiliza una pistola de aire con un filtro de 0,45 micrones para eliminar cualquier burbuja residual. Luego, el molde se coloca sobre una placa calefactora de 80 grados durante una hora para su curado.

Si no se dispone de un desecador al vacío, la mezcla maestra puede dejarse a temperatura ambiente durante varias horas. Las burbujas de aire eventualmente desaparecerán por sí solas. Si no se dispone de una placa calefactora, el PDMS se curará a temperatura ambiente después de 24 horas.

Es importante asegurarse de que el molde esté nivelado durante el proceso de curado. Una vez que el PDMS está curado sobre el molde, se traslada a una cabina limpia utilizando una hoja quirúrgica. Se realiza un corte circular alrededor del perímetro de los dispositivos.

Es importante que, al insertar la cuchilla en el PDMS para hacer contacto con la oblea de silicio, no se ejerza demasiada presión sobre la oblea, ya que de lo contrario el molde se agrietará con un corte circular alrededor de todos los dispositivos. Hay cuatro dispositivos por cada molde de silicio de tres pulgadas. El PDMS se levanta cuidadosamente del molde.

Esto puede iniciarse girando suavemente la hoja quirúrgica mientras se inserta en el corte previo. Es realmente delgado con los dispositivos de PDMS sobre el molde. Los depósitos con orientación hacia arriba se perforan en el dispositivo utilizando un punzón de biopsia de tejido de ocho milímetros.

Los restos que quedan en el punzón se expulsan con una varilla. Luego, los dispositivos se dividen en cuartos y se recorta el exceso de PDMS para que el dispositivo quede ajustado correctamente sobre un cubreobjetos Corning. Se utiliza aire de nitrógeno con un vidrio número uno de 24 milímetros por 40 milímetros para eliminar cualquier residuo adicional.

Los residuos persistentes también se pueden eliminar utilizando cinta vinílica 3M Scotch Brand 4 7 1. Los dispositivos limpios ya están listos para la unión por plasma. Se utiliza un limpiador de plasma Herrick para unir brevemente los dispositivos neuronales a las laminillas.

Los dispositivos y las laminillas se colocan sobre una bandeja, y luego la bandeja se introduce en el limpiador de plasma y se utiliza una bomba de vacío para extraer el aire de la cámara. Es importante tener en cuenta que los dispositivos de PDMS se colocan con la cara hacia arriba, es decir, con el diseño hacia arriba, para que queden expuestos al gas de plasma.

Una vez que la presión de vacío ha alcanzado 300 millitorr, se enciende la energía en la bobina eléctrica y se ajusta a máximo. Se abre ligeramente la puerta para permitir que un poco de aire entre en la cámara, lo cual ayudará a generar el plasma. Los dispositivos y el vidrio de cubierta se tratan con plasma durante dos minutos.

Observe el color púrpura en la cámara. Ese es el plasma real. La bobina eléctrica crea plasma, que es un gas parcialmente ionizado compuesto por electrones, iones y átomos o moléculas neutros.

El plasma crea especies reactivas en la superficie del vidrio y del dispositivo, las cuales, cuando se colocan juntos, formarán un enlace permanente. El plasma también hace que la superficie sea hidrofílica, lo que facilita la adición de líquidos. El limpiador de plasma también esteriliza los dispositivos.

Después de tratar con plasma durante dos minutos, se apaga la potencia en el vacío y se introduce aire en la cámara. Las superficies tratadas con plasma del vidrio y del dispositivo microfluídico se ensamblan en contacto mutuo sobre una bancada limpia. Luego, los dispositivos se colocan en placas estériles de 60 milímetros.

Las superficies del vidrio y del dispositivo tratadas con plasma forman un enlace estrecho e irreversible. Dentro de los 10 minutos posteriores a la unión por plasma, se añade poliol lisina al dispositivo. Después de 10 minutos, la hidrofilicidad del dispositivo disminuirá.

Lo que dificulta que el PLL entre en el dispositivo. Es importante verificar la presencia de burbujas de aire en el dispositivo después de añadir el PLL. Un método sencillo para eliminar las burbujas de aire presentes es usar una pipeta P200 cargada con 100 microlitros de líquido.

En este caso, coloque la punta de PLL directamente en la abertura del canal principal, luego presione con fuerza la P200. Puede ser necesario repetir este paso varias veces, pero eventualmente la fuerza del pipeteo expulsará las burbujas. Los dispositivos que contienen PLL se dejan incubar durante la noche en un incubador estándar de cultivo celular a 37 grados con 5% CO2.

Después de 24 horas de incubación con PLL, los dispositivos se enjuagan rápidamente dos veces con agua desionizada de autoclave. Durante este proceso, el líquido nunca se elimina por completo de los canales principales, solo de los depósitos. Eliminar el líquido de los canales principales introducirá burbujas.

Después de dos enjuagues rápidos, los dispositivos se llenan nuevamente con agua desionizada para autoclave y se colocan de nuevo en la incubadora durante un mínimo de tres horas o durante la noche. Al día siguiente, tras incubar los dispositivos con agua durante la noche o un mínimo de tres horas, se trasladan nuevamente a la cabina de seguridad biológica y se enjuagan dos veces con agua desionizada. Luego, se añade a los dispositivos el medio basal neural que contiene los suplementos necesarios, B 27 y glutamato, para el cultivo de neuronas primarias de rata.

A continuación, los dispositivos se devuelven al incubador para su uso futuro. Ahora los dispositivos están listos para alojar neuronas. En este video, hemos demostrado la técnica de litografía suave, que utilizamos para fabricar nuestros dispositivos neuronales.

Estos dispositivos pueden utilizarse para cultivar neuronas y otros tipos celulares de interés. La ventaja principal de estos dispositivos es la capacidad de separar y compartimentalizar el cultivo de los cuerpos celulares neuronales en un lado del dispositivo de una fracción pura de axones en el otro lado del dispositivo. En el siguiente video, le mostraremos cómo preparamos neuronas corticales fetales de rata E 18 y cómo cargamos las células en el dispositivo.

Así que eso es todo desde el laboratorio de John. Gracias por vernos.