Conteo de células madre neurales humanas
22 de agosto de 2007
El conocimiento del número exacto de células viables se requiere para muchos manipulaciones de cultivo de tejidos. Este protocolo describe cómo diferenciar entre células vivas y muertas y cuantificar las células usando un hemocitómetro. A pesar de que describe contar humana madre neurales / células precursoras (hNSPCs), que puede ser utilizado para otros tipos celulares.
Ahora voy a mostrarle cómo contar células precursoras neuronales humanas. Usted contaría sus células cuando desee utilizarlas para inmunohistoquímica o cuando desee realizar una transfección con maquinaria de factores nucleares. Utilizo un hemocitómetro de contraste de fase que tiene una cuadrícula de borde y también usamos un colorante llamado azul de tripano. El colorante es útil porque puede diferenciar entre células vivas y muertas.
Las células muertas o en proceso de muerte captan este colorante y aparecen azules. Cuando observa las células en el hemocitómetro, las células viables son capaces de excluir este colorante y, por lo tanto, no se ven azules. De esta manera, puede determinar la viabilidad de sus células para preparar una solución de tripano azul y medio.
Voy a agregar 20 microlitros de la solución de trampa y azul a este tubo eppendorf de 0,5 ml. Luego voy a agregar 25 microlitros de medio. De esta manera, en este momento tendré 45 microlitros de una solución de trampa, azul de anilina y medio, de modo que cuando agregue cinco microlitros de la suspensión celular, obtendré una dilución uno a diez.
Ahora voy a añadir cinco microlitros de la suspensión celular. Primero me aseguraré de que las células estén bien resuspendidas mediante vortexado con los dedos. Ahora quiero asegurarme de que esta solución esté bien mezclada.
Así que voy a subir y bajar la cama varias veces. Finalmente, voy a cargar aproximadamente 12 microlitros de esta suspensión celular en un hemocitómetro. Tiene dos puertos y se puede utilizar cualquiera de los dos.
Entonces, todo lo que tiene que hacer es introducir la solución en este puerto y el líquido será absorbido por acción capilar. Y ahora estoy listo para contar. Aquí se observa el hemocitómetro a 10 x y aquí tenemos un cuadrante que contiene 16 cuadros.
Y como puede observarse, aquí podemos observar células vivas y muertas. Aquí tenemos células vivas como esta, esta y esta. Y también tenemos algunas células muertas como esta.
Si observa, la célula muerta aparece de color azul oscuro, mientras que las células vivas tienen una especie de halo alrededor. Ahora voy a contar todas las células vivas. Voy a desplazarme de izquierda a derecha y de arriba hacia abajo.
1, 2, 3, 4, 5, 6, 33, 1 32, 33, 34, 3 5, 3 6. Entonces tenemos un total de tres seis células en este cuadrante. Por lo tanto, cuando veo células que están en el límite del cuadrante, como a lo largo de esta línea aquí, para ser coherente, cuento las células que están en el borde izquierdo y en el borde superior.
Y cuento sistemáticamente las células en esos bordes para todos los cuadrantes del hemocitómetro. Ahora vamos a calcular cuántas células tenemos por microlitro. Para ello, tomaré el promedio de células por cuadrante, que es 38, y lo multiplicaré por 10, que es un factor determinado por las dimensiones de la cámara.
Y también vamos a multiplicar por 10, que es nuestro factor de dilución en este caso. Y al final, obtendremos el número de células por microlitro. Así que en este caso tenemos 3.800 células por microlitro.
Y dado que resuspendimos nuestro pellet celular en 500 microlitros de solución, puede calcular cuántas células tiene en total. Y ya está todo listo.
Vea la transcripción completa y acceda a miles de videos científicos
Descripción general
Este protocolo describe un método para contar células madre/neurales precursoras humanas (hNSPCs) utilizando un hemocitómetro. Destaca la importancia de diferenciar entre células vivas y muertas para diversas aplicaciones en cultivo de tejidos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Cultivo de tejidos
Antecedentes
- El recuento de células viables es fundamental para las manipulaciones de cultivo de tejidos.
- Las células vivas pueden excluir ciertos colorantes, mientras que las células muertas no pueden.
- El hemocitómetro es una herramienta estándar para el recuento de células.
- El colorante azul de tripano se utiliza comúnmente para evaluar la viabilidad celular.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un método confiable para contar hNSPC.
- Diferenciar eficazmente células vivas y muertas.
- Ayudar a los investigadores a prepararse para experimentos posteriores, como inmunoquímica o transfección.
Métodos Utilizados
- Uso de un hemocitómetro de contraste de fase.
- Aplicación del colorante azul de Trippan para distinguir la viabilidad celular.
- Conteo de células bajo un microscopio.
- Preparación de una solución de azul de Trippan y medio.
Resultados principales
- Diferenciación exitosa entre células vivas y muertas.
- Cuantificación precisa de las hNSPCs.
- Demostación de la eficacia del colorante azul de Tripano.
- Validación del hemocitómetro como método de conteo confiable.
Conclusiones
- El protocolo proporciona un enfoque sencillo para el recuento de células.
- Es aplicable a diversos tipos de células más allá de las hNSPCs.
- Comprender la viabilidad celular es esencial para experimentos exitosos de cultivo de tejidos.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La cuantificación precisa de células viables de stem/precursoras neurales humanas (hNSPCs) es esencial para obtener protocolos reproducibles de cultivo de tejidos en el descubrimiento de fármacos en neurociencia. Este protocolo permite evaluar de forma confiable la viabilidad celular y medir la concentración, lo que favorece una siembra experimental consistente para aplicaciones posteriores, como la inmunocitoquímica y la transfección. Al estandarizar la discriminación entre células vivas y muertas mediante el azul de tripano y el recuento basado en hemocitómetro, el método mejora la confianza predictiva en las etapas iniciales de validación de dianas y en los procesos de desarrollo de ensayos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la siembra precisa de hNSPCs para estudios de interacción con objetivos y modulación de vías.
- Valor operativo: Reduce la variabilidad en los ensayos celulares al garantizar una entrada consistente de células viables.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Proporciona datos cuantitativos y reproducibles sobre la concentración celular, fundamentales para la estandarización de ensayos.
- Valor operativo: Facilita la preparación escalable de suspensiones celulares para formatos de cribado de alto contenido.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Mantiene la consistencia de la entrada celular en las etapas de transición de descubrimiento a preclínica.
- Valor operativo: Facilita la colaboración entre diferentes funciones mediante prácticas estandarizadas de conteo celular.
Integración de la Secuencia de Trabajo y Flujo de Trabajo
Este método se enmarca dentro del continuo de descubrimiento temprano, facilitando la preparación confiable de células desde la validación del objetivo hasta la optimización del ensayo y las pruebas preclínicas de eficacia.
- Biología del Descubrimiento: Asegura una dosificación celular precisa para experimentos de validación de dianas que involucran hNSPCs.
- Tamizaje: Proporciona entradas celulares estandarizadas y cuantificables necesarias para el rendimiento reproducible de ensayos.
- Análisis: Genera resultados de concentración celular viable y recuento total utilizados para normalizar las condiciones experimentales.
- Investigación Traducional: Sostiene la continuidad en el manejo celular entre el descubrimiento in vitro y los modelos preclínicos.
- Reutilización Empresarial: Representa una capacidad transferible y de baja complejidad aplicable a múltiples tipos celulares y proyectos.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Mejora la confianza predictiva al minimizar la variabilidad en las entradas experimentales basadas en células.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y la estandarización entre laboratorios y equipos.
- Valor estratégico: Apoya decisiones más sólidas de avance o interrupción mediante bases de ensayos confiables.
- Impacto en la cartera: Permite un avance ajustado al riesgo al garantizar la calidad de los datos en las pruebas iniciales de eficacia.
Consideraciones de Implementación
- Requiere técnicas básicas de cultivo de tejidos y dominio de microscopía.
- Depende de la disponibilidad de un hemocitómetro y de su limpieza adecuada para evitar contaminación.
- Necesita una capacitación constante del operador para garantizar una selección imparcial de cuadrantes y el cumplimiento de las reglas para el conteo de células en los bordes.
- Limitado por la capacidad de conteo manual; no es adecuado para automatización de alto rendimiento sin adaptaciones.
- Depende de la dilución y mezcla correctas para asegurar un muestreo representativo de la suspensión celular.
