Cromosómicas asociadas trampa para la identificación de largo alcance Interacciones ADN

El objetivo general del siguiente experimento es descubrir e identificar los fragmentos de ADN asociados a larga distancia. Esto se logra mediante la fijación, la lisis celular y la digestión del ADN con la primera enzima de restricción, seguida de una ligación para crear un ADN quimérico compuesto por segmentos de los dos genes asociados. A continuación, se añaden adaptadores al ADN quimérico tras la segunda digestión de restricción para facilitar su amplificación. Luego se realiza la amplificación por PCR utilizando cebadores específicos para los adaptadores y el ADN cebo, con el fin de obtener cantidades suficientes de los fragmentos de ADN asociados. Los resultados obtenidos muestran los fragmentos de ADN asociados a larga distancia con el ADN cebo, basándose en el análisis de secuencias de los fragmentos de ADN amplificados.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la captura de conformación de cromosomas o tres C, es que A-C-T-S-A puede utilizarse para identificar eficazmente un asociado de ADN desconocido a largo alcance. Mientras que tres C surgió para la verificación de interacciones previamente sospechadas únicamente. Para comenzar este protocolo, cultive células humanas en un incubador provisto con 5% de dióxido de carbono a 37 grados Celsius hasta que alcancen una confluencia del 80 al 90%.

Se utilizan células de leucemia promielocítica ácida humana para esta demostración. Recolecte las células vertiéndolas en un tubo NOC de 50 mililitros y centrifugue a 1200 RPM durante 15 minutos. Tras la centrifugación, elimine el medio mediante aspiración.

Añada cinco mililitros de medio de cultivo para resuspender los pellet celulares. Después de contar las células con un citómetro de hemocitómetro, tome aproximadamente un por diez a la séptima células hasta un volumen de 40 mililitros con RPMI 1640, medio que contiene 10% FBS. Luego añada 1,7 mililitros de formaldehído al 37% para fijar la cromatina diluida.

Incube la muestra a temperatura ambiente durante 10 minutos con agitación suave. Tras la incubación, detenga la reacción con 2,4 mililitros de glicina dos molar. A continuación, centrifugue la muestra durante 15 minutos a 1200 RPM y cuatro grados centígrados.

Tras eliminar el sobrenadante, lave el sedimento una vez con 40 mililitros de PBS frío con hielo, luego centrifugue la muestra para recuperar el sedimento celular lavado. Re suspenda el sedimento resultante en 40 mililitros de tampón de lisis frío con hielo, con inhibidores de proteasas recién añadidos y PMSF 0,1 milimolar. Incube la muestra en cámara fría con agitación rotatoria durante 90 minutos. Finalmente, centrifugue la muestra a 2.500 RPM durante 15 minutos, elimine el sobrenadante y obtenga los núcleos aislados. Re suspenda los núcleos en 0,5 mililitros de tampón NEB 1X y añada 15 microlitros de SDS al 10 %.

Incube la muestra a 37 grados Celsius durante una hora con agitación. Luego, agregue 45 microlitros de Triton X-100 al 20% para secuestrar el SDS e incube nuevamente a 37 grados Celsius durante una hora con agitación y una alícuota de uno por diez a la sexta. Los núcleos, o aproximadamente 15 microgramos, se utilizan para la digestión con enzima de restricción en 55 microlitros de solución de núcleos.

Añada 433 microlitros de un tampón XNEB tres y 12 microlitros de BGL dos. Para obtener un volumen total de reacción de digestión de 500 litros, incube la reacción a 37 grados Celsius durante la noche. Al día siguiente, inactivar la enzima de restricción añadiendo 95 microlitros de SDS al 10% y desnaturalice la enzima calentando a 65 grados Celsius durante 20 minutos.

En un baño de agua, agregue siete mililitros de tampón de ligación 1x y 360 microlitros de Triton X-100 al 20%. Incube la muestra a 37 grados Celsius durante una hora. Reduzca la temperatura a 16 grados Celsius y agregue 50 microlitros de 400 unidades por microlitro.

T cuatro ADN ligasa. Incube la reacción de ligación a 16 grados Celsius durante cuatro horas y luego a temperatura ambiente durante 30 minutos. Una vez completada la ligación, agregue 300 microgramos de proteinasa K e incube a 65 grados Celsius durante la noche.

Luego, agregue cinco microgramos de RNAA e incube a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Purifique el ADN mediante extracción con fenol-cloroformo y precipite el ADN en isopropanol; disuelva el ADN precipitado en 150 microlitros de agua destilada estéril. Para agregar conectores al ADN quimérico, primero digiera el ADN incubando dos microgramos de ADN purificado con cinco unidades de MspI a 37 grados Celsius durante cuatro a seis horas. Tras la digestión, inactível el MspI a 65 grados Celsius durante 10 minutos.

Luego precipite el ADN en etanol con un microlitro de cinco miligramos por mililitro de glucógeno. Disuelva el sedimento de ADN resultante en 50 microlitros de agua destilada estéril. A continuación, mezcle 50 microlitros de ADN tratado con MSP1 con dos microlitros de un oligonucleótido conector de 20 micromolar (L) y un microlitro de un oligonucleótido S de 20 micromolar; luego añada un microlitro de agua destilada estéril y seis microlitros de tampón 10X para ADN ligasa T4.

Cubra la mezcla con cera líquida. Desnaturalice los oligonucleótidos a 50 grados Celsius durante un minuto y deje enfriar gradualmente hasta 10 grados Celsius en un gradiente de 0,5 grados Celsius por minuto. Utilizando un termociclador, añada un microlitro de ligasa de ADN T4 de 400 unidades por microlitro e incube la reacción a 15 grados Celsius durante la noche.

Al día siguiente, purifique el ADN ligado al conector utilizando un kit de purificación rápida de PCR Kaya y eluya en 50 microlitros de agua destilada estéril. Luego, elija un cebador para la región específica de ADN que se investigará en cuanto a interacciones de largo alcance. En este ejemplo, Abel se utilizará como cebador o cebo.

Prepare el ADN purificado para la primera ronda de PCR combinando un microlitro del ADN purificado con un microlitro de un cebador específico de la sonda uno de 20 micromolar, 46 56, y un microlitro de un cebador específico del conector de 20 micromolar, 29 63. Luego agregue tres microlitros de tres x ClinTech, una mezcla de ADN polimerasa que previamente se ha mezclado con 32 P-D-C-T-P según el protocolo escrito, seguido de tres microlitros de agua destilada estéril. Realice la amplificación por PCR utilizando el ciclo térmico de PCR con inicio en caliente descrito en el protocolo escrito después de que el ciclo de PCR haya finalizado.

Purifique los productos de la PCR de primera ronda utilizando un kit de purificación rápida de PCR kaya. Eluya en 30 microlitros de agua destilada estéril. Utilice un microlitro del producto de la primera PCR diluido 100 veces para realizar una segunda ronda de PCR usando cebadores anidados, añadiendo un microlitro de cebador específico de la amplicón uno de 20 micromolar, 46 26, y un microlitro de cebador específico del conector de 20 micromolar, 29 61.

Nuevamente, agregue tres microlitros de tres veces ClinTech, ADN polimerasa, un cóctel y tres microlitros de agua destilada estéril. Realice la segunda ronda de PCR utilizando un programa de termociclado de 25 ciclos de 95 grados Celsius durante 20 segundos, 67 grados Celsius durante 40 segundos y 72 grados Celsius durante un minuto, seguido de una extensión a 72 grados Celsius durante cinco minutos.

Visualice los productos de PCR mediante la realización de un gel de PAGE al 5 % con urea y luego escanee la pantalla expuesta en un imagenador de fósforo. Cada banda de PCR puede recuperarse del gel disolviendo las tiras de gel en un tubo Eppendorf que contiene 60 microlitros de agua destilada estéril e incubando a 95 grados Celsius durante cinco minutos. Centrifugue brevemente los productos de gel disueltos a 10,000 RPM durante 10 segundos.

Para recopilar todas las muestras. Retire un microlitro para usarlo como molde de ADN para realizar la PCR con la reparación de cebadores. 29 61 46 26.

Utilizando las mismas condiciones descritas anteriormente, tras la purificación, se puede realizar un análisis de secuenciación con una herramienta en línea para determinar la ubicación cromosómica. Una vez en el sitio de bioinformática genómica, haga clic en blatt para generar una nueva ventana y pegue la secuencia de ADN. Después de enviar la secuencia de ADN, aparecerán los resultados de la búsqueda BLATT.

Haga clic en el navegador sobre el resultado con 100 % de identidad para revelar la ubicación de la secuencia de ADN. La región able one se utilizó como cebo para determinar sus interacciones de ADN a largo alcance. Se seleccionaron dos sitios BGL two y un sitio BAM H one para el ensayo A CT en la segunda ronda del conjunto de cebadores de PCR; el 46 26 29 61 se utilizó para amplificar able M1; el 46 30 29 61 se utilizó para able M two y el 46 36 29 61 se utilizó para able M three.

Un patrón típico de gel revela de una a varias bandas, como se muestra aquí para el clon M1 capaz, el clon M2 capaz y el clon M3 capaz. Se muestra la secuencia de ADN del clon M1 capaz para demostrar que cada fragmento proveniente de un ensayo A CT consta de dos segmentos de ADN combinados. Un segmento se deriva de la región de ADN cebo, mientras que el segundo segmento proviene del compañero asociado.

Los segmentos se unen entre sí mediante la primera secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción. La secuencia de reconocimiento de la segunda enzima aparecerá al final de la secuencia del compañero asociado. El fragmento M1 clonable contiene ADN de la región de ABLE uno localizada en el cromosoma nueve Q 32.4, y el compañero asociado se encuentra en el cromosoma tres P tres, que fue identificado como proc dos.

De manera similar, la proteína asociada M dos se localizó en el cromosoma cinco Q 21.1, mientras que el clon M tres se identificó como una asociación intracromosómica cerca del locus ABLE uno, en contraste con los ensayos 3C. La metodología descrita en este video permitirá seleccionar las interacciones de largo alcance más prevalentes. Sin embargo, al aumentar el número de ciclos de PCR, es posible identificar también asociaciones adicionales menos frecuentes utilizando la región de impronta y control o ICR en el locus IGF two H 19 como ADN cebo en células de fibroblastos de ratón; se aplicaron diferentes programas de ciclado en la primera y segunda ronda de PCR en el ensayo A CT.

El ensayo A CT también puede utilizarse para identificar diferencias en la arquitectura nuclear e interacciones de largo alcance entre células normales y células cancerosas. Se homogenizaron tejido colon normal y tejido de cáncer de colon, y se realizó el ensayo A CT siguiendo los procedimientos descritos aquí. Se muestra aquí la estructura del ADN de la región ICR en el locus IGF two H 19 y el gen IGF two dpn.

Dos sitios para el ensayo A CT están etiquetados; los cebadores utilizados en la PCR de segundo ciclo están marcados con flechas y números en diferentes colores. El patrón del gel del ensayo A CT representa los resultados de la PCR utilizando el cebador 29 61 junto con cada uno de los pares de cebadores 41, 61, 41 63, 51 45 y 51 51. Las bandas únicas que aparecen solo en tejido normal del colon están marcadas con flechas amarillas, y aquellas bandas que aparecieron únicamente en tejido de cáncer de colon están indicadas con flechas rojas tras su desarrollo.

Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la biología de mercado exploren la arquitectura nuclear y la regulación génica de manera tridimensional.