La cartografía y la aplicación de potenciador de la trampa de expresión Flippase en larvas y adultos Drosophila SNC

El objetivo general del siguiente experimento consiste en perfeccionar la expresión de GAL cuatro mediante el uso de lipasa específica de tejido junto con herramientas conversoras de GAL 80. Esto se logra generando una colección de líneas transgénicas de moscas con trampa de potenciadores Philippe y determinando el patrón de expresión de la lipasa en el SNC de cada línea. Mediante inmunohistoquímica con reportero GFP y reportes GFP, se puede diferenciar la expresión GL de la expresión neuronal para intersectar la expresión de GAL cuatro en líneas de interés, líneas ET flip, en las moscas que contienen una herramienta conversora de GAL 80 en la descendencia.

El análisis clonal puede utilizarse para analizar el refinamiento de la expresión de GAL cuatro, como en el ojo. La ventaja principal de esta técnica frente a los métodos existentes es que las líneas basadas en el seguimiento de potenciadores junto con herramientas de conversión GAL 80 pueden usarse con una colección rápida de alianzas GAL cuatro ya disponibles en la comunidad de la mosca. Además, este concepto puede ampliarse a otros organismos modelo emergentes con GAL cuatro UAS, como el pez cebra.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la cartografía de circuitos neuronales que subyacen al comportamiento. Aunque este protocolo demuestra el uso de la base flip en un subconjunto de células fotorreceptoras, el método interseccional puede aplicarse al análisis de otros tejidos, incluidos los tejidos no neuronales. A medida que se caracterizan más líneas de lipasa con trampa de potenciadores.

El sistema GAL4-UAS es una técnica importante ampliamente utilizada por los biólogos que trabajan con moscas. Una limitación de la mayoría de las líneas GAL4 es que se expresan de forma demasiado amplia para poder utilizarse en la cartografía cerebro-comportamiento mediante los métodos de activación genética. No es posible ajustar finamente la expresión de GAL4 en tejidos de interés antes de emplear un transgén ET-FLP para restringir parcialmente la expresión de las líneas GAL4.

Primero es útil conocer el patrón de expresión del transgén ET flip x dos en larvas en etapas tardías de desarrollo y en adultos, para visualizar la expresión de flip a en el SNC. Establezca un cruce entre machos que portan el transgén de interés ET t flip X dos y hembras vírgenes que poseen un reportero GFP para la expresión de et flip. Recopile larvas F1 de tercer estadio errantes para su disección. Colóquelas en un platillo S guard limpio, elimine cualquier residuo con un pincel y enjuague el platillo una vez con PBS al 1x.

Ahora, llene el recipiente con PBS frío al hielo una vez para anestesiar las larvas y acceder al SNC de una larva; sostenga su gancho bucal con un par de pinzas. Agarre la cutícula cerca de la esfera anterior extendida y levántela. El SNC permanece unido al gancho bucal junto con algunas otras estructuras.

Ahora, con pinzas, retire todas las estructuras excesivas que rodean el SNC mientras disecciona el SNC. Transfiera cada uno individualmente a un recipiente Pyrex de tres cavidades lleno con PBS. Una vez que todos los SNC hayan sido diseccionados, fíjelos sumergiéndolos completamente en 200 microlitros de PFA al 4% sobre hielo.

Si un SNC flota, no se ha limpiado completamente de todos los tejidos circundantes. En caso de que esto ocurra, utilice un par de pinzas para volver a sumergir el SNC en el fijador después de fijar durante 15 minutos, lave el tejido con PBS frío tres veces y luego lave el tejido otras tres veces con PBT frío. El tejido ya está listo para ser observado mediante imágenes, marcado con anticuerpos o almacenado en PBT a cuatro grados Celsius para su uso posterior.

Tinción a partir del mismo cruzamiento utilizado para recolectar larvas, recolecte adultos F1 antes de la disección. Sumerja de cinco a diez moscas y enfríe etanol al 95 % durante 30 segundos para eliminar la cera de la superficie de la cutícula. Para eliminar el etanol, lave los adultos tres veces con PBS frío al hielo al 1× y, tras el tercer lavado, transfiera uno de ellos a una placa de 35 milímetros con fondo de silicio rellena con PBS frío al hielo al 1× para preparar un adulto para la disección.

Colóquelo con el lado ventral hacia arriba e inserte un alfiler en el centro del abdomen. Comience la disección utilizando pinzas para retirar las patas. Luego retire la cutícula de la cabeza sujetando la cabeza en las propas y, al mismo tiempo, desprendiendo la cutícula desde debajo del ojo hacia la parte superior de la cabeza.

Utilizando con cuidado pinzas afiladas, retire y separe los tejidos que rodean el cerebro, ya que estos tejidos presentan una fuerte autofluorescencia y hacen que el cerebro flote durante la fijación. El cerebro es solo una parte del SNC adulto. La otra parte es la cuerda nerviosa ventral o VNC en el tórax, que también debe diseccionarse.

Primero, retire el cutículo torácico sujetando la mosca en la base de la pata trasera y retirando suavemente el cutículo torácico hasta la base del cuello. Segundo, para exponer la cuerda nerviosa ventral, separe suavemente las dos mitades del cutículo torácico. Tercero, retire el abdomen del tórax sujetando en la base de la segunda pata y separando el abdomen desde cerca del primer esternito abdominal.

Cuarto, limpie el CVM asegurándolo en la zona humeral y retirando suavemente el tejido que rodea el CVM. Separe el anillo de tejido conectivo que rodea la conexión cervical y continúe eliminando el tejido excesivo mientras recolecta el cerebro. A continuación, transfiera el cerebro y el CVM, en forma de peras, a una placa Pyrex de nueve cavidades llena con PBS frío al 1x, mantenida sobre hielo.

Para fijar los tejidos adultos, sumérjalos en PFA al 4% sobre hielo durante 15 minutos. Luego, realice tres lavados con PBS frío sobre hielo y tres lavados con PBT. Ahora el tejido está listo para ser analizado mediante imágenes o marcado con anticuerpos para estudiar con precisión la expresión del transgén.

Es útil etiquetar el SNC con marcadores neuronales o gliales para proporcionar un marco de referencia; comience por incubar el tejido a cuatro grados Celsius durante la noche con anticuerpos contra neuronas o glía al día siguiente. Lave la preparación cinco veces con PBT e incube con el anticuerpo secundario fluorescente a temperatura ambiente durante dos horas. Envuelva la placa con papel de aluminio para evitar el fotoblanqueo del anticuerpo cuando finalice la incubación.

Lave la preparación con PBS y monte completamente la preparación sobre un portaobjetos. Utilice un anillo de plástico OSHA para evitar que el tejido sea aplastado por el cubreobjetos. El sistema nervioso ya está listo para ser examinado en busca de patrones de expresión de GFP y LL mediante un microscopio fluorescente.

Normalmente se examinan de tres a cinco réplicas para determinar la reproducibilidad del patrón de expresión de flip. El patrón de expresión de flip en la línea flip puede utilizarse junto con otros transgenes para modificar la forma en que se expresa el represor GAL cuatro GAL 80. Modificar la expresión del represor GAL 80 es un método eficaz para realizar cambios.

En la expresión GAL cuatro, un método consiste en eliminar la expresión de GAL 80 mediante un transgén que inactiva GAL cuatro, el cual de otro modo provocaría degeneración ocular en todo el ojo. La línea ET flip hash 6 88 A se utiliza aquí para evaluar la eficacia de la herramienta de conversión GAL 80 en un subconjunto de fotorreceptores en la progenie F1, comparando el fenotipo ocular con el fenotipo ocular de las cepas parentales. Cualquier aparición de deformidad ocular o despigmentación confirma que el patrón de expresión flip está presente en los fotorreceptores y que la eliminación de GAL 80 fue exitosa.

Una estrategia complementaria no redundante consiste en activar la expresión de GAL80 utilizando la misma línea de recombinación de interés. Esta estrategia es muy similar a la anterior, pero ahora se suprime la pigmentación y la degeneración en la descendencia F1. En flip X dos.

Expresión de fotorreceptores Una vez dominada, la disección del SNC puede realizarse en aproximadamente cinco minutos en adultos y un minuto en larvas, si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante utilizar pinzas afiladas para eliminar la tráquea y el tejido que rodea tanto a adultos como a Libre C y Ss. Es fundamental usar un recipiente libre de fijador para la disección. Actualmente, el choque térmico seguido de inversión se utiliza para generar clones aleatorios.

En contraste, el método de captura de potenciadores mediante flip permite generar clones reproducibles, lo que facilita el análisis morfológico y conductual. Otra ventaja del método del dedo es que se podrían restringir aún más los patrones de expresión de GAL4 utilizando líneas adicionales basadas en la captura de potenciadores mediante flip y otras líneas gal. Una debilidad de la configuración de GAL80 con stop en tubulina es que ciertas combinaciones de GAL4 y efectores UAS, como LAG4 y U-A-S-K-I-R, no son compatibles porque matarían a las moscas.

Este problema puede superarse fácilmente utilizando un efector condicional UAS, como UAS Shiri Ts, que permite examinar un comportamiento a temperaturas restrictivas, tal como se esperaba. No todas las líneas de atrapamiento de potenciadores de lipasa expresarán niveles suficientemente altos de lipasa como para ser útiles. No obstante, la técnica del dedo descrita aquí proporciona un enfoque nuevo para que los investigadores de Drosophila perfeccionen el análisis de mosaicos, ya sea para circuitos de desarrollo o para el comportamiento.