La caracterización de compuestos volátiles bacteriana secundaria con ionización electrospray espectrometría de masas (SESI-MS)

La ionización secundaria por pulverización electrospray, espectrometría de masas o CS EMS permite el análisis de volátiles bacterianos sin necesidad de ningún tratamiento previo de la muestra. El espacio de cabeza del cultivo bacteriano es desplazado por dióxido de carbono hacia la cámara de reacción CS SI. A medida que los compuestos volátiles atraviesan la cámara de reacción SSI, pasan a través de la nube de pulverización electrospray y se ionizan.

Una vez ionizados, los compuestos volátiles son extraídos hacia el espectrómetro de masas para su análisis. El exceso de gas portador y los volátiles bacterianos no reactivos pasan a través de un filtro de 0,22 micrones para eliminar cualquier agente bacteriano, como medida adicional de protección, y son expulsados hacia una campana química. En definitiva, este protocolo de EM con ionización por captura de iones (CSI) ofrece perfiles de volátiles bacterianos en cuestión de minutos.

Se prevé que esta tecnología pueda utilizarse en muchas aplicaciones, incluyendo el aire espirado, el análisis del aliento para enfermedades infecciosas, o incluso aplicarse a sistemas alimentarios donde podríamos detectar rápidamente patógenos presentes en o sobre nuestros alimentos. Esta técnica presenta varias ventajas principales frente a métodos existentes como GCMS, espectrometría de masas y PT, RM S. En primer lugar, los compuestos volátiles no requieren ningún tratamiento previo antes del análisis.

Segundo, es posible fragmentar iones específicos en la mezcla volátil, lo que facilita la identificación de compuestos. Y tercero, es rápido. Normalmente toma menos de cinco minutos.

Para analizar cada muestra, elija el recipiente adecuado para cultivar su cultivo, considerando los requisitos de crecimiento de la especie, así como la entrega eficiente de los compuestos volátiles al espectrómetro de masas. En esta demostración, hemos seleccionado botellas estándar de medio de cultivo de 100 mililitros de vidrio pyrex. Los volátiles bacterianos se entregan al espectrómetro de masas mediante un flujo de gas portador para armar el portador.

Las líneas de gas se ajustan a los frascos de cultivo con tapas roscadas que tienen al menos dos puertos de conexión. Inserte las líneas de entrada y salida de gas a través de los puertos de conexión y tape cualquier puerto adicional antes de incubar sus muestras. Presurice los recipientes y sumérjalos en agua para verificar fugas.

Las fugas de gas son una causa principal de resultados atípicos en forma de señales iónicas volátiles débiles o ausentes que aumentan durante la noche. Cultivos de e coli, K 12 y pseudomonas aerogen, PAO uno en LB Lennox preparando dos réplicas biológicas para cada especie.

Prepare nueve frascos estériles de cultivo que contengan 50 mililitros de LB Lennox y un frasco sin inocular que se utilizará como blanco; inocule cada cultivo nocturno en dos frascos de muestra. Creando réplicas técnicas, incube los cultivos y el blanco durante 24 horas a 37 grados Celsius. Dado que el CEMS está diseñado específicamente para muestrear compuestos volátiles, limite el uso de productos de cuidado personal perfumados antes de utilizar el instrumento con precisión.

Tape todos los productos químicos volátiles en el laboratorio y controle las corrientes de aire tanto como sea posible durante las pruebas para evitar la contaminación de su instrumento y de las líneas de transferencia de gas. Con agentes biológicos viables, instale filtros del tamaño de poro adecuado en la línea de gas portador. Los filtros no interferirán con la transferencia de compuestos volátiles a la cámara de reacción sesi, pero podrían afectar ligeramente la eficiencia de la transferencia de aerosoles.

Para verificar que la fuente de voltaje está apagada y que el sistema está descargado de electricidad, compruebe que las luces indicadoras de la fuente de voltaje estén apagadas. Asegúrese de que el voltaje en el multímetro sea cero y conecte a tierra las puntas eléctricas. En este momento, instale la solución de electroaspersión para su análisis.

En modo de iones positivos, utilizamos una solución de electroaspersión compuesta de 0,1 % de ácido fórmico, 5 % de metanol y 94,9 % de agua. Para lograr una intensidad y estabilidad óptimas de la señal, encienda el gas portador de dióxido de carbono y ajuste el caudal a dos litros por minuto. Aplique presión al depósito de electroaspersión para iniciar la entrega de la solución de electroaspersión a la cámara de reacción a un caudal de cinco nanolitros por segundo. A continuación, encienda la fuente de voltaje y ajuste el voltaje a 2,5 kilovoltios.

El voltaje aplicado afecta la intensidad del ion señal y la estabilidad del cono de electro-spray para los voltajes de nuestro sistema entre dos y cinco kilovoltios. Proporcionan los mejores resultados en modo de iones positivos. Ejercer precaución, ya que en este punto las superficies metálicas de la fuente de ionización son capaces de producir una descarga peligrosa. Ahora configure un método de ajuste para monitorear el espectro de SEMS.

Desactive la casilla de adquisición de múltiples canales o MCA. Establezca el tiempo de adquisición entre 10 y 15 minutos e inicie la adquisición de datos. Observe los espectros del fondo del gas portador y realice ajustes finos al voltaje aplicado para obtener un cromatograma de iones totales estable y escaneos reproducibles.

Continúe recolectando espectros y A TIC durante cinco minutos para asegurar que el instrumento se haya estabilizado con el instrumento asegurado. Ingrese los parámetros de adquisición según sea apropiado para su experimento. Registre un espectro de fondo del gas portador para experimentos futuros.

Para recopilar un espectro en blanco. Dirija el flujo de gas portador a través de las líneas de derivación y luego conecte la muestra en blanco, con las válvulas cerradas, a las líneas de transferencia del instrumento. Abra las válvulas hacia el frasco de la muestra y cierre las válvulas de las líneas de derivación.

Para obtener espectros reproducibles. Permita que el sistema se equilibre durante 30 segundos, tiempo durante el cual la humedad en la cámara de reacción se estabiliza. Para asegurar que el sistema ha alcanzado el equilibrio, supervise la CIC, que cambiará durante el período de equilibración y luego se estabilizará.

Una vez que el sistema esté equilibrado, inicie la recopilación del espectro. Después de recopilar el espectro, retire el frasco de la muestra abriendo primero las líneas de derivación del gas portador. Luego cierre las válvulas de la muestra.

Y por último, retire el frasco de la muestra. Lave el sistema con el gas portador durante dos a cuatro minutos para eliminar la humedad y los compuestos volátiles absorbidos de las líneas de transferencia y evitar la contaminación cruzada entre muestras. Recolecte datos del perfil volátil de cada muestra bacteriana, recolectando intermitentemente espectros en blanco adicionales para asegurar una sustracción completa del blanco.

Las huellas volátiles en modo de iones positivos para E. coli y P. aeruginosa, cultivadas aeróbicamente en LB Lennox durante 24 horas a 37 grados Celsius, son distintas. El espectro volátil de E. coli está dominado por un pico a una relación masa/carga de 118, mientras que el espectro de Pseudomonas aeruginosa contiene una mayor variedad de picos atribuibles a proteínas.

Al intentar este procedimiento, es importante que registre los parámetros instrumentales que ha optimizado para su análisis, como el voltaje aplicado, la composición de la solución de electroaspersión y la velocidad de flujo del gas portador. También es fundamental que conserve registros de sus espectros representativos para poder reproducir sus análisis en el futuro. No olvide que trabajar con bacterias patógenas y alto voltaje podría ser extremadamente peligroso.

Por lo tanto, siempre se deben tomar precauciones como limitar el acceso al CSS CMS durante el experimento. Ahora debería poder obtener de forma reproducible un CSS y un espectro EMS de los volátiles bacterianos en su sistema. Buena suerte.