Los microchips de silicio para la Manipulación de la interacción célula-célula

Hola, soy Elliot Hu. Soy investigador posdoctoral en el laboratorio de Tia aquí en el Instituto de Tecnología de Massachusetts. Hoy vamos a preparar cultivos celulares en chips micro-mecánicos de silicio. Los dispositivos tienen forma de peines pequeños que se encajan entre sí y nos permiten manipular con precisión las interacciones entre dos poblaciones celulares diferentes.

Hoy vamos a estudiar la interacción entre los hepatocitos hepáticos y las células estromales de apoyo. Específicamente, se cultivan células de fibroblastos 3T3 en la superficie superior de los peines, de modo que al desplazar los dedos del peine, se pueden mover las células y modificar su disposición espacial. Cada dispositivo se divide en dos partes que se unen mediante dos configuraciones posibles.

La primera pone en contacto a las dos poblaciones celulares entre sí. La segunda separa ligeramente a las dos poblaciones de manera que las células no puedan tocarse. Aquí, se evitan las interacciones por contacto, pero se mantienen las interacciones mediante factores secretados.

Comencemos hablando sobre cómo manipular las piezas con pinzas. Me gusta usar tanto pinzas más grandes de teflón como pinzas metálicas más pequeñas con punta redondeada. Con las pinzas más grandes, se pueden tomar las piezas por los bordes así; con las piezas más grandes con brazos, hay que tener cuidado de no romper los brazos porque son muy frágiles.

Así que desea tomarlos por la parte trasera de este modo. Con las pinzas de metal, puede introducirlas en el orificio y recoger los fragmentos directamente. Las piezas más grandes caben en un pocillo de una placa de 12 pocillos, mientras que las piezas más pequeñas caben en una placa de 24 pocillos o pueden emparejarse con la pieza más grande.

En una placa de 12 pocillos, normalmente uso la pinza metálica. Cuando manipulo las piezas en las placas para unirlas, generalmente coloco primero la pieza más grande dentro del pocillo y la empujo completamente hacia un lado. Luego tomo la pieza complementaria y la coloco en el otro lado del pocillo, y las junto utilizando dos pinzas, una en cada pocillo.

Ahora puedo simplemente bloquear las piezas juntas, ya sea en la configuración de separación o en la configuración de contacto. Si quiero separar las piezas, prefiero tirar de ellas hacia la configuración de separación y luego tirar verticalmente hacia arriba para retirar la pieza. Ahora bien, los dispositivos están hechos de silicio, por lo que deben recubrirse para permitir una adecuada adhesión celular.

Probablemente recibirá los dispositivos ya recubiertos con poliestireno y tratados con plasma, por lo que asumiremos que ese es nuestro punto de partida. En primer lugar, utilizaremos colágeno para recubrir la superficie a la que se adherirán los hepatocitos. Colocaremos los peines de hepatocitos en una solución de colágeno de 50 microgramos por mililitro y los incubaremos a 37 °C durante 45 minutos.

Los peines de fibroblastos, por otro lado, no necesitamos recubrirlos. Después de la incubación, aspiramos la solución de colágeno y lavamos con agua. Ahora vamos a fijar las ES juntas en contacto con partes complementarias para formar una superficie plana para la siembra celular.

Primero, llenaremos algunos pozos con etanol al 70%. Colocaré un par en cada pozo y luego los fijaré juntos. Después de fijarlos, queremos observar las piezas bajo el microscopio para asegurarnos de que sean coplanares.

De vez en cuando, las piezas pueden bloquearse juntas de forma desalineada. Y en el microscopio observará que se encuentran en dos planos focales diferentes. En este caso, simplemente separe las piezas y vuélvalas a unir, después de verificar que el alineamiento es correcto. Dejamos las piezas en etanol durante un tiempo para esterilizarlas.

A menudo tengo prisa, así que simplemente dejo en remojo durante 10 minutos. Después de la esterilización, debemos enjuagar. Aspirar completamente el etanol y lavar con agua, luego aspirar y lavar nuevamente con agua, y finalmente aspirar el agua y reemplazarla con el medio de cultivo.

Ahora vamos a sembrar células en los dispositivos. Normalmente, suspendemos las células a una concentración de 500.000 células por mililitro, y pipeteamos un mililitro de suspensión sobre cada par de peines utilizando una placa de 12 pocillos. Así, sembramos los fibroblastos a 500.000 células por mililitro en dos de los pocillos.

De manera similar, tomamos una suspensión de 500.000 hepatocitos por pocillo y los sembramos en los otros dos pocillos. Ahora, antes de la incubación, vamos a agitar bien las células para asegurarnos de que se distribuyan uniformemente. Me gusta agitar tres veces verticalmente, tres veces horizontalmente y luego repetir este procedimiento tres veces.

Después de agitar, colocaremos la muestra en el incubador y dejaremos que las células reposen durante 15 minutos, momento en el cual las agitaremos nuevamente. Después de agitar cada 15 minutos durante una hora, aspiraremos la suspensión celular y pasaremos a una nueva suspensión de células. Repetiremos este procedimiento hasta obtener una capa de células confluentes.

Normalmente con fibroblastos, se requiere uno o dos asentamientos. Y con hepatocitos puede requerirse de dos a cuatro asentamientos. Para obtener una monocapa confluente, las células se siembran a una densidad bastante alta; la agitación asegura que las células se distribuyan uniformemente.

Después del primer aislamiento, se forma una capa escasa de células. Observe que las células solo se adhieren a los dedos que han sido recubiertos con poliestireno y colágeno. Después de sembrar células frescas e incubar durante otra hora, nuevamente agitando cada 15 minutos, la capa celular se vuelve más densa.

Después del tercer siembra, tenemos una buena densidad celular y ahora podemos detenernos después de que las células hayan sido sembradas sobre los peines. Deseamos manipular las células para llevarlas a la configuración experimental deseada. Los dispositivos se separan ahora de sus partes complementarias y se incuban durante 24 horas.

Después de 24 horas, las células se han extendido para formar una monocapa confluente sobre la superficie de los peines. Ahora queremos formar un cultivo conjunto. El peine de hepatocitos y el peine de fibroblastos se transfieren ahora al mismo pocillo y se ensamblan juntos en la configuración inicial deseada.

Si se desea. Después de un cierto período de tiempo, se puede cambiar la configuración. Por ejemplo, podemos pasar a la configuración de separación después de 18 horas; las piezas se colocan en el mismo lugar, se empujan juntas hasta alcanzar la configuración de separación y luego se vuelven a empujar en contacto, regresando a la configuración de separación.

Ahora vamos a retirar un peine. Lo que haremos a continuación es pasar por el proceso de eliminar la capa antigua de poliestireno, limpiar los chips y luego aplicar una nueva capa de poliestireno y prepararlos para el cultivo celular. Nuevamente, al eliminar la capa antigua de poliestireno y aplicar una capa nueva, nos aseguramos de que ningún residuo del experimento anterior interfiera con un nuevo experimento.

Entonces, después de terminar su experimento, lo primero que debe hacer es tratar sus células con lejía y luego enjuagar los peines y el agua. Antes de colocar los chips en el toing, debe asegurarse de que estén completamente secos. Aquí tenemos algunos peines que acabo de dejar secar al aire durante un tiempo y estoy verificando que estén totalmente secos.

Y ahora vamos a tomar un poco de toing y colocarlo en este altavoz de vidrio. Vamos a usar una pipeta de vidrio aquí para que no se disuelva. Halloween disuelve el plástico, por lo que no podemos usar una pipeta típica de poliestireno.

Vale, eso es más o menos suficiente. Ahora tomaremos algunas de estas piezas, las colocaremos en el recipiente y encenderé el agitador para mezclarlas, y las cubriremos con papel de aluminio para evitar que el tolueno se evapore. Después de dos horas, el tolueno debería haber disuelto la mayor parte del poliestireno en los peines, y podremos retirarlos y secarlos al aire.

Después del enjuague posterior a Halloween, las piezas deben estar relativamente libres de poliestireno y relativamente limpias. Sin embargo, necesitamos que las piezas estén extremadamente limpias para que la nueva capa de poliestireno forme una buena adhesión, ya que, si no están extremadamente limpias, el poliestireno tiende a desprenderse en medio del experimento cuando las células comienzan a tirar de él.

Lo que vamos a hacer ahora es una limpieza con ácido piraña. He colocado las piezas en un vaso de vidrio y vamos a calentar esto. Así que lo colocaremos sobre una placa calefactora.

Aquí tenemos ácido sulfúrico y peróxido de hidrógeno. Voy a verter primero el ácido sulfúrico y, aquí, asegúrese de que todos los chips queden sumergidos bajo el líquido. A veces tienden a flotar.

Y también, ahora que estamos trabajando con productos químicos bastante corrosivos, asegúrese de usar el equipo de protección adecuado. Aquí, llevo guantes de nitrilo. Ahora vamos a verter el peróxido de hidrógeno en el ácido, y tenga cuidado porque se trata de una reacción exotérmica.

Así puede verse que desprende un poco de humo mientras reacciona, pero deseamos añadir algo de energía al sistema para hacerlo aún más reactivo. Ahora lo calentaremos hasta 120 grados Celsius, aproximadamente 120 ahora, de modo que puede tener la seguridad de que cualquier resto de su cultivo celular será completamente eliminado de sus chips. En este punto, debe permitir que la reacción siga su curso completo hasta que todo el peróxido de hidrógeno sea consumido.

Y en ese momento, la mezcla dejará de burbujear. De modo que la reacción tarda aproximadamente media hora en completarse. Y después de que dejen de verse las burbujas, simplemente puede apagar la placa calefactora y dejar que se enfríe.

Y vamos a transferirlos a una curva de agua BAK. Y nuevamente, asegúrese de usar pinzas de teflón aquí, no metálicas, y simplemente puede recogerlas y transferirlas. Ahora vamos a enjuagarlas bajo un flujo constante de agua DDH₂O. Usualmente la tomo directamente del Meine y la dejaremos corriendo durante al menos 10 minutos aquí.

Y al hacerlo, eliminaremos todos los restos de ácido tras picarlos, enjuagándolos bajo un chorro de agua durante 10 minutos. El ácido debe eliminarse completamente de las láminas, y luego las mantendremos sumergidas en agua hasta el momento en que estemos listos para recubrir la policristalina con poliestireno de peso molecular 45.000 que obtuvimos de Sigma. Y vamos a pesar una pequeña cantidad aquí.

Tenemos 400 miligramos y vamos a disolverlos en tolueno a 100 miligramos por mililitro. Por lo tanto, el tolueno debe manipularse en la campana extractora. Y la otra consideración es que, dado que vamos a usar tolueno para disolver poliestireno, queremos asegurarnos de no usar ninguna prenda de laboratorio hecha de poliestireno.

Aquí estamos utilizando polipropileno, un tubo cónico y una pipeta de vidrio. Dado que tengo 400 miligramos de poliestireno, voy a añadir cuatro mililitros de tolueno. Ahora vamos a vórtex durante media hora hasta que el poliestireno se disuelva. Ahora simplemente vamos a vórtex el tubo a la velocidad más baja durante aproximadamente 20 minutos a media hora.

Ahora voy a colocar el tubo en el vórtex. No necesito sostenerlo durante todo el tiempo. Después de 20 a 30 minutos, el poliestireno debería haberse disuelto y estaremos listos para recubrirlo.

Ahora vamos a aplicar el recubrimiento por centrifugado del poliestireno en nuestras instalaciones. Nuestro equipo de recubrimiento por centrifugado se encuentra en un entorno de sala limpia. Por lo tanto, aquí debemos usar gorro, gafas, bata, fundas para zapatos y guantes, aunque esto podría no ser igual en sus instalaciones.

Antes de usar este portabrocas, quiero protegerlo del poliestireno. Por lo tanto, lo cubriremos con papel de aluminio y queremos que quede lo más plano posible sobre la superficie para que el chip pueda asentarse completamente contra ella. Vamos a hacer un pequeño orificio justo en el centro para poder mantener al chip bajo vacío.

El centrifugador se configura a 2 400 RPM y 30 segundos. Ahora podemos tomar uno de nuestros chips, colocarlo de forma que el centro del chip cubra el orificio, y al principio mantendré el vacío apagado cuando coloque el poliestireno, luego encenderé el vacío y a continuación iniciaré la centrifugación. Para las partes más pequeñas, podemos colocar apenas menos de 10 gotas.

Y para las piezas más grandes, se necesitan un poco más de 10 gotas de poliestireno. Y vamos a centrifugar durante 30 segundos a 2.400 RPM. Ahora vamos a tomar los chips recubiertos con poliestireno y colocarlos en el horno a 120 grados C, lo cual está por encima del punto de transición vítrea del poliestireno.

Por lo tanto, volverá a fundir la superficie para alisarla un poco, y también densificará y endurecerá el plástico. Por lo general, lo dejo en el horno durante toda la noche. Probablemente toma al menos unas pocas horas para que el proceso se complete.

Después de un horneado nocturno, los chips están listos para el tratamiento con plasma. Ahora vamos a exponer el poliestireno a un plasma de oxígeno, lo que cambiará la energía superficial para que las proteínas y las células se adhieran mejor. Simplemente cargaremos los chips en la cámara de plasma y se bombeará hasta alcanzar el vacío.

Un buen ajuste para usar es 200 mil, un ciclo de vacío y 200 vatios de potencia durante un minuto bajo un flujo de gas oxígeno. Ahora que el sistema ha sido evacuado, vamos a introducir el oxígeno. Bien, ahora podemos encender la potencia de RF y generar el plasma durante un minuto.

Así, cuando el plasma está en funcionamiento, en realidad emite luz. Es como una bombilla fluorescente. Después de un minuto de exposición al plasma, vamos a restaurar la presión hasta la atmosférica y podremos retirar las piezas.

Ahora las piezas están listas para el recubrimiento con proteínas y la alimentación celular. El objetivo al diseñar este dispositivo fue permitirnos manipular la microarquitectura del tejido de manera dinámica. De este modo, la microorganización del tejido en el cuerpo, específicamente la ubicación de las células unas respecto a otras, es muy importante para determinar la función de cada célula particular en cultivo de laboratorio.

Hasta hace poco, no habíamos podido hacer un buen trabajo replicando eso, pero en los últimos cinco o diez años, las personas han comenzado a poder microdibujar células sobre un sustrato de cultivo de tejidos, colocando así las células exactamente donde deseamos que estén en una placa de cultivo celular. Al hacerlo, han podido descubrir algunos aspectos importantes de la biología básica de las interacciones célula-célula a escala microscópica. Ahora bien, lo que no hemos podido hacer hasta este momento es realizarlo de forma dinámica.

Es decir, cambiar la organización de un cultivo celular en medio del experimento. Y eso es importante porque en el organismo, el tejido no es en realidad un entorno estático. Tenemos células que se desplazan y se reorganizan, particularmente durante la cicatrización de heridas o el desarrollo.

Pero incluso en un órgano normal en homeostasis, hay muchas cosas moviéndose. El aspecto técnico más difícil de aprender es simplemente cómo manipular físicamente las partes. Y al principio, cuando comience a trabajar con el sistema, podría sentirse intimidado por lo frágiles que son las partes o por lo pequeños que deben ser los movimientos que necesita hacer.

Pero creo que si practica un poco con él, no debería tener demasiados problemas. Algunos de los lugares donde observamos que este dispositivo tiene un papel, por ejemplo, en el desarrollo embrionario, son aquellos en los que las células entran en contacto con una serie de entornos celulares diferentes mientras brotan a través de varias capas embrionarias. Y se sabe que las interacciones con cada una de las capas, a medida que entran en contacto secuencialmente, impulsan a las células por una vía específica de diferenciación.

Por lo tanto, consideramos que este tipo de dispositivo podría ser útil para intentar replicar ese tipo de evento en el laboratorio. Uno de los aspectos de la microorganización que deseábamos examinar especialmente fue la diferencia entre células que se comunican mediante interacciones por contacto, en las que las membranas celulares pueden tocarse entre sí, frente a factores solubles que se secretan al medio circundante y se difunden hacia una célula que se encuentra un poco más alejada. Y muchas veces, cuando las células están en cultivo conjunto y ejercen un efecto entre sí, no ha quedado claro si dichas interacciones se deben a contactos directos o a factores secretados que desempeñan el papel principal.