A β-glucuronidasa (GUS), basada en células de ensayo Muerte

El objetivo general de este procedimiento es utilizar un sistema reportero Gus para analizar las propiedades de muerte potenciales de genes específicos. Los genes de interés se clonan en un casete Gus y se cultivan en los vectores de agrobacterium apropiados bajo un promotor 35 s. Estos vectores se transforman luego en la cepa de Agrobacterium LBA 44 0 4, y se mezclan con un cultivo que contiene un casete de expresión Gus para infiltrar hojas de Nick Oceana Hamana.

La actividad de Gus puede evaluarse visualmente mediante tinción histoquímica o cuantitativamente mediante el ensayo fluorométrico mug. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el ensayo de escalera de ADN o el ensayo TUNEL, comúnmente utilizados en sistemas de mamíferos pero difíciles de reproducir en plantas, es que se trata de un ensayo transitorio sensible y rápido basado en plantas que aprovecha la sencilla realidad de que se requieren células vivas para que ocurra la expresión de gas. Quien demostrará el procedimiento hoy será Hua RAOs.

Un investigador asociado posdoctoral en nuestro laboratorio indica que la infiltración requiere hojas completamente expandidas y sanas de plantas de nicotiana benthamiana de tres a seis semanas de edad, cultivadas a 25 grados Celsius. Planifique realizar este protocolo durante ocho días. En el día uno, realice estrías a partir de stocks glicerolados de agrobacterium tumefaciens que contengan los vectores para el ensayo de muerte celular y el vector con el casete de expresión de Gus; incluya siempre un vector vacío como control negativo o relleno cuando se prueben múltiples combinaciones de cultivos.

Incube las placas a 28 grados Celsius durante dos días. Al tercer día, inocule dos mililitros de LB selectivo con una colonia individual de cada placa. Incube cada cultivo agitando a 28 grados Celsius durante 24 horas a 200 RPM hasta alcanzar la densidad máxima de crecimiento.

Después de 24 horas de incubación, resuspender completamente la cultura mediante pipeteo si hay agregación, y aumentar el volumen total de cada cultura a 10 mililitros con LB selectivo fresco para inducir los genes de virulencia de agrobacterium. Añadir acetona hasta alcanzar 25 micromolar e incubar cada cultura con agitación a 28 grados Celsius durante otras 16 horas. El siguiente paso consiste en centrifugar cada cultura a 4.000 G durante 10 minutos a temperatura ambiente y resuspender el sedimento en 10 mililitros de medio de infiltración.

No agregue acetona, centrifugue nuevamente los cultivos, pero ahora suspenda cada pellet en cinco mililitros de medio de infiltración que contenga 100 micromolares de acetona. Ahora mida la DO a 600 nanómetros.

Concentraciones tan bajas como 0,1 son aceptables, pero si son mayores de 0,9, dilúyalas hasta 0,9 con medio de infiltración y acetona antes de la infiltración. Incube nuevamente las culturas a 28 grados Celsius con agitación durante tres horas tras la incubación. Mezcle las culturas experimentales y las culturas control en una proporción uno a uno con la cultura que contiene el casete Gus.

Para cada cultivo, utilice una jeringa de un mililitro sin aguja para infiltrar el sello de ABA o el envés de las hojas recién emergentes. El volumen de infiltración no es importante. Cuando se forme un área de empapamiento por agua, significa que se ha agregado suficiente cantidad; infiltre entonces el control negativo y el gen a analizar en hojas opuestas de la misma planta, e infiltre después otras dos plantas de la misma manera.

Por lo tanto, hay tres plantas por cada cultivo. Tres días después de la infiltración, es momento de recolectar las hojas y analizar la expresión de la proteína gust. Inicie el análisis histoquímico infiltrando al vacío toda la hoja con sustrato xlu hasta que esté completamente impregnada.

Ahora, incubar las hojas en la oscuridad a temperatura ambiente durante la noche o hasta que aparezca una tinción azul marcada cuando la tinción azul sea evidente. Enjuagar las hojas con agua destilada e incubarlas en etanol al 70 % durante la noche hasta que se elimine la clorofila. Al día siguiente, enjuagar las hojas con agua destilada y evaluar los niveles de expresión de GUS.

Para cuantificar la expresión de Gus, un sustrato mug se convierte en un producto fluorescente mu, que puede medirse comenzando por moler discos foliares infiltrados en un mortero usando nitrógeno líquido. A continuación, añada 100 microlitros de tampón de extracción de GUS mientras mantiene la muestra en hielo. Luego centrifugue la suspensión a 14.000 ×g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius y recoja el sobrenadante que contiene las proteínas solubles totales, que incluye Gus.

Mida la concentración total de proteína soluble utilizando un NanoDrop y ajuste la concentración a 100 microgramos de proteína total para cada muestra en tampón de extracción Gus. Ahora, agregue sustrato mug en tampón de extracción Gus a cada muestra hasta una concentración final de dos milimolar de mug. Un volumen total de 100 microlitros por muestra debe ser suficiente, mezcle mediante pipeteo e incube la reacción durante una hora a 37 grados Celsius.

Después de una hora, detenga la reacción añadiendo 800 microlitros de tampón de parada de gusts. Para cuantificar, se cargan 100 microlitros de cada muestra en una placa de microtitulación, que se analiza en un lector de placas; se mide la fluorescencia con longitudes de onda de excitación de 365 nanómetros y emisión de 455 nanómetros, y se compara con una curva patrón. La actividad de Guss puede entonces expresarse como M de mu por microgramo de proteína soluble total por minuto de reacción. Se detectan diversos niveles de gust dependiendo del constructo utilizado cuando el casete de expresión de GUS se co-infiltra con un regulador negativo de la muerte celular o un gen anti-muerte.

Se observan altos niveles de Gus en comparación. Los niveles de Gus en el control con vector vacío son mucho más bajos. Por el contrario, cuando se utiliza un regulador positivo de la muerte celular o un gen pro-muerte, se observa una marcada reducción en la expresión de Gus en comparación con el control con vector vacío.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente una semana. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que esta técnica se utiliza como un paso inicial para determinar el potencial de genes específicos. Se necesita realizar un trabajo adicional para confirmar estos resultados iniciales y para determinar el tipo de célula implicada.