ampliPHOX colorimétrico de detección de un microarray de ADN para la influenza

El objetivo general del siguiente experimento consiste en utilizar un método nuevo y rápido de amplificación de señales para detectar y caracterizar subtipos virales de la gripe en la plataforma de microarreglo de baja densidad denominada «flu chip». Esto se logra incorporando DTP biotinilados y utilizando cebadores con un extremo fosfato en la posición cinco prima para amplificar el segmento del gen matriz y un segmento del gen no estructural a partir de extractos de ARN de influenza. A la PCR le sigue una digestión enzimática y fragmentación para generar un producto viral amplificado, monocatenario, biotinilado y corto, el cual luego se hibrida con el arreglo tras la hibridación.

La detección Fox utiliza la fotopolimerización para generar grandes manchas poliméricas donde ocurre la hibridación, y se emplean patrones diferenciales de hibridación para detectar subtipos virales de la influenza. La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como la detección estándar mediante fluorescencia es que es bastante económica y proporciona un resultado rápido visible a simple vista, con una sensibilidad analítica similar a la de la fluorescencia. Aunque este método puede aportar información sobre la caracterización de virus de la influenza mediante el uso del chip de gripe, ya que es un método de detección universal.

Ampl Fox también puede aplicarse a una amplia variedad de otros sistemas, como microarreglos de baja densidad basados en ADN y proteínas. En teoría, cualquier producto biotinilado debería poder detectarse utilizando amox. El procedimiento será demostrado por Amber Taylor, una científica asociada, y Kevin Moulton, un asistente de investigación aquí en Endeavor, quienes han sido fundamentales en el desarrollo del instrumento Fox y de la química de detección durante los últimos años.

Extraiga ARN viral de 200 microlitros de aislado viral utilizando un kit de extracción de ARN viral y el protocolo del fabricante. Eluya 60 microlitros de volumen final y almacene los extractos a menos 70 grados Celsius o más frío para su uso posterior. Luego, prepare la mezcla maestra de R-T-P-C-R sobre hielo según el protocolo del fabricante.

Utilizando una mezcla de dNTP BIOTINILADOS, agregue la mezcla de cebadores para el chip de fluorescencia, que contiene las concentraciones indicadas, a la mezcla maestra. Un cebador de cada conjunto debe contener un grupo fosfato en el extremo cinco prime para facilitar la digestión enzimática. El conjunto de cebadores para la gripe A produce un producto de 1032 pares de bases, y el conjunto de cebadores para la gripe B produce un producto de 811 pares de bases.

Vortexee brevemente y distribuya 18 microlitros de la mezcla maestra en tubos PCR de pared delgada. A continuación, agregue dos microlitros de la plantilla de ARN a cada tubo de reacción. Transfiera los tubos PCR a un termociclador y utilice un perfil de amplificación con una temperatura de hibridación adecuada.

El perfil de ciclado utilizado en este ensayo se muestra aquí. Prepare la mezcla de digestión enzimática combinando 2,2 microlitros de tampón de reacción enzimática, 0,8 microlitros de agua libre de nucleasas y 1,0 microlitro de enzima lambda exonucleasa por reacción en cadena de la polimerasa. Retire las muestras del ciclador térmico y añada cuatro microlitros a cada tubo de PCR.

Devuelva las muestras al ciclador térmico y programe el ciclador térmico a 37 grados Celsius durante 15 minutos, seguido de 95 grados Celsius durante 10 minutos. A continuación, coloque pozos de hibridación de un solo uso alrededor de las micromatrices que se van a hibridar. Luego, lave las laminillas en 110 mililitros de agua purificada en un agitador orbital durante cinco minutos.

Seque las laminillas tocando suavemente con una toallita absorbente el borde del pocillo. Combine 22 microlitros de tampón de hibridación 2x con cada uno de los productos de ADN de cadena sencilla fragmentados, mezcle brevemente y pipetee 40 microlitros dentro de los pocillos del microarreglo. Deje que las laminillas se hibriden durante una hora en una cámara de humedad; tras la hibridación, retire las laminillas de la cámara de humedad y enjuague brevemente cada laminilla con dos mililitros de tampón de lavado D. Coloque las laminillas en un portaportas.

A continuación, agregue 110 mililitros de los tampones de lavado A y B a recipientes separados utilizando un agitador orbital. Lave la bandeja de portaobjetos en el tampón A a 60-90 RPM, la velocidad utilizada para todos los lavados posteriores, durante un minuto. Luego, retire la bandeja de portaobjetos del tampón de lavado A y enjuáguela brevemente con el tampón de lavado D. Transfiera la bandeja de portaobjetos al tampón de lavado B y lávela en el agitador orbital durante cinco minutos.

Después de lavar, seque suavemente los arreglos en cada portaobjetos con una toallita de papel y coloque los portaobjetos secos en la cámara de humedad. Como preparación para los pasos de detección mediante métrica de color fox, combine 10 microlitros de amplitud, 20 microlitros de tampón de amplitud 2x y 10 microlitros de agua purificada por cada arreglo a procesar, transfiera 40 microlitros de la mezcla de marcado a cada arreglo y permita que la reacción de marcado transcurra en una cámara de humedad cerrada durante cinco minutos. Durante la hibridación, prepare 110 mililitros de tampón de lavado C en un recipiente. Después del marcado, enjuague inmediatamente cada arreglo con tampón de lavado D. Coloque cada portaobjetos en el portaobjetos y lávelo en tampón de lavado C en un agitador orbital durante cinco minutos; tras el lavado con tampón C, sumerja brevemente el portaobjetos tres veces en un recipiente con agua purificada.

Para eliminar los residuos de sal, seque las matrices como se mostró anteriormente. Almacene las matrices en una caja de portaobjetos oscura hasta la fotoactivación e imagen, lo cual debe completarse dentro de las 24 horas. A continuación, encienda el lector Amli Fox y asegúrese de que el software Amli View esté listo para la fotoactivación antes de la detección de la muestra de la matriz.

Primero, determine el tiempo óptimo de activación fotográfica para todas las muestras siguiendo un breve procedimiento de calibración. Una vez por cada uso diario, caliente la solución Amplify a temperatura ambiente y vortexe brevemente para mezclar; pipetee tres microlitros de potenciador Amplify en el vial de Amplify y vortexe completamente. Aplique uniformemente durante 10 segundos 40 microlitros de la solución Amplify a una sola portaobjetos a la vez, asegurándose de que no haya burbujas presentes.

Inserte la lámina de microarreglo en la bahía de activación fotográfica del lector Amplify. Inicie la activación fotográfica seleccionando "inicio" en el software de vista PL, utilizando el tiempo de activación fotográfica determinado en el proceso de calibración. Una vez finalizado, enjuague el microarreglo con dos mililitros de agua purificada para eliminar el exceso de polímero amplificado. Ahora se ha producido la formación de polímero claro en los puntos que contienen ADN diana, aunque es más fácil visualizarla.

Después de la tinción, deje secar las manchas de polímero durante dos minutos. Luego, distribuya dos gotas de amply red sobre la matriz y permita que la tinción continúe durante dos minutos. Después de la tinción, enjuague rápidamente la laminilla con agua purificada y séquela como se mostró anteriormente; inserte la laminilla en la bahía de imagen del lector Amli Fox para obtener una imagen utilizando el software amli para procesar los resultados. La imagen izquierda muestra la detección de una muestra del nuevo H1N1 de 2009 mediante Amli Fox.

Aunque la imagen de la derecha utiliza la fluorescencia tradicional generada por un escáner micromatricial de fluorescencia confocal, el mismo patrón general de detección se puede observar fácilmente en ambos métodos. Sin embargo, el resultado de Amli fox es visible a simple vista. Estas imágenes muestran los resultados de la prueba flu chip de origen humano, H tres N dos de origen humano, H uno N uno de origen porcino, H uno N uno, y una matriz negativa de fox sin influenza detectable.

Las secuencias dos y tres resaltadas en azul producen señal para todos los subtipos de influenza mostrados, pero las secuencias resaltadas en rojo en la parte inferior derecha solo producen señal para la muestra de origen porcino, H uno N uno. La muestra negativa muestra señal en una secuencia de control interno resaltada en verde, lo que indica ausencia de inhibición o fallo en la reacción de R-T-P-C-R.

Una vez dominado, todo el proceso, desde la extracción del vial hasta la detección de amox y la interpretación del resultado final, puede realizarse en aproximadamente seis horas. La parte de detección Ampl Fox del procedimiento, incluida la calibración del instrumento, puede completarse en unos 30 minutos siguiendo este protocolo. Pueden realizarse otros métodos, como el secuenciamiento parcial o completo del genoma, para responder preguntas adicionales.

Este ensayo de influenza tiene como finalidad ser una cribado inicial, particularmente para muestras que presentan un patrón de hibridación único. Dado que la detección es un ensayo general, esperamos que los investigadores encuentren nuevas y novedosas aplicaciones de microarreglos de baja densidad para las cuales la detección podría aportar valor.