Imágenes en directo de extrusión celular de la epidermis del pez cebra en desarrollo

El mantenimiento de los tejidos epiteliales requiere la eliminación continua de células dañadas y en muerte sin interrumpir la función de barrera. Para lograrlo, el epitelio extruye las células en muerte mediante la formación y contracción de un anillo de actina y miosina en la célula que rodea a la célula moribunda, expulsándola mientras cierra cualquier brecha que pudiera haberse generado tras su salida. En este artículo en video, se presenta un método para inducir y visualizar en tiempo real la extrusión de células apoptóticas desde el epitelio de larvas de pez cebra.

En el ejemplo mostrado, esto se logra mediante la inyección de una sonda de F-actina marcada con una proteína fluorescente roja en embriones transgénicos de pez cebra de un estadio celular que expresan la proteína fluorescente verde en el epidermis, para visualizar los filamentos de actina en los tejidos epiteliales. Las larvas de día cuatro, posteriores a la personalización, que expresan tanto GFP como RFP, se tratan entonces con G418 para inducir apoptosis en el epidermis. La dinámica de la actina y los cambios en la forma de las células epiteliales que ocurren durante la extrusión se visualizan mediante imágenes de lapso de tiempo en un microscopio confocal de disco giratorio.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes como el análisis por inmuno fuerza es que podemos observar cambios rápidos y la dinámica de la actina que ocurren durante el proceso de extrusión en un tejido epitelial vivo. En este video, les mostraremos un procedimiento para obtener imágenes en tiempo real de la extrusión de células apoptóticas del epidermis de pez cebra en desarrollo. Utilizamos este procedimiento en nuestro laboratorio para comprender cómo las células reorganizan coordinadamente su citoesqueleto de actina para eliminar células apoptóticas mientras mantienen la función de barrera, y cómo la alteración del proceso de extrusión puede conducir a ciertos estados patológicos.

Así que comencemos. Para visualizar la dinámica de la actina durante la extrusión celular en el epidermis de pececillos cebra en desarrollo, comience por descongelar el ARN transcrito previamente sobre hielo. Transcribimos ARNm que codifica una proteína fluorescente roja fusionada al dominio de homología de calpa de utrofina y proteína ligadora de actina. Añada rojo de fenol al ARN en una proporción uno a uno para obtener una concentración final de ARN de aproximadamente 30 nanogramos por microlitro y cargue un microlitro de la solución en una aguja capilar estirada mediante llenado por detrás.

Recolecte alrededor de 75 embriones de C-K-G-F-P en estadio de una sola célula en tampón E tres. Pipetee los embriones recolectados hacia el molde de microinyección utilizando una pipeta de pasta de cinco y tres cuartos y oriente suavemente los embriones en la ranura con pinzas FST Dumont número cinco. Trabaje rápidamente para evitar tener que inyectar el ARN en embriones de múltiples estadios bajo un microscopio estereoscópico de disección de laboratorio estándar.

Utilice un microinyector controlado por presión para inyectar el ARN en la yema de los embriones como fósil de fenol. Después de la inyección, debe observarse un color rojo en el embrión. Asegúrese de inyectar al menos 50 embriones para cada experimento.

Seleccione los embriones para eliminar los huevos no fertilizados o dañados e incube todos los embriones restantes a 28 grados Celsius. Después de 24 horas, utilice un microscopio estereoscópico fluorescente para seleccionar embriones de pez cebra que presenten un alto nivel de fluorescencia GFP en el epitelio y fluorescencia de actina marcada con RFP. Incube los embriones seleccionados a 28 grados Celsius hasta que estén listos para proceder con el tratamiento farmacológico para inducir la apoptosis mediante exposición al aminoglucósido.

El antibiótico G cuatro 18 o un medicamento provoca la extrusión de células apoptóticas del epitelio de las larvas de pez cebra en desarrollo. Es importante destacar que este tratamiento solo funciona en larvas de cuatro días post fertilización o mayores para inducir la extrusión celular. Recolecte hasta 25 larvas de pez cebra de cuatro días post fertilización que expresen tanto GFP como RFP en un plato de cultivo de 35 por 10 milímetros que contenga tres mililitros de medio E tres.

Reemplace cuidadosamente el medio con tres mililitros de E tres que contenga un miligramo por mililitro de G cuatro 18 e incube la larva en la droga durante cuatro horas en la oscuridad a 28 grados Celsius. Luego retire el medio y sustitúyalo por medio E tres precalentado que contenga trica al 0,02 % y proceda al montaje de las larvas para la obtención de imágenes. Transfiera hasta tres larvas a un tubo fendor de 1,5 mililitros y retire la mayor parte del medio E tres.

Con una punta de pipeta cortada, pipetee 120 microlitros de agarosa al 1 % de fusión baja dentro del tubo para mezclar. Luego, pipetee suavemente la mezcla de larvas y agarosa sobre el cubreobjetos en el fondo de una placa de cultivo Matech. Utilizando un portapinzas FST con una aguja insertada o una aguja de tungsteno sujeta, oriente rápidamente las larvas de modo que queden rectas y planas contra el cubreobjetos.

Deje solidificar el aose. Luego, llene suavemente el recipiente con medio E tres que contiene 0,02 % de trica. Hemos encontrado que todo el proceso de extrusión de células apoptóticas desde el epitelio de las larvas de pez cebra en desarrollo tarda aproximadamente 20 minutos.

Aquí demostramos cómo configurar un experimento de imágenes de lapso de tiempo utilizando un microscopio confocal de disco giratorio y el software and or IQ para recopilar una serie temporal de planos Z a través de una sola capa del epitelio de pez cebra. Primero, encienda los láseres de argón y helio-neón, la cámara del microscopio y la lámpara de fluorescencia epiluminiscente dentro del software and or IQ. Cree un protocolo de serie temporal que contenga las longitudes de onda que se van a imaginar.

La frecuencia de los intervalos entre las capturas de imágenes y el número de veces que debe repetirse la captura. Coloque suavemente la placa de cultivo que contiene la muestra sobre la platina del microscopio y luego utilice un objetivo de 20 aumentos con luz transmitida para enfocar las larvas. Coloque el objetivo de inmersión en agua de 40 aumentos en la posición correcta. Con este objetivo, podemos filmar aproximadamente de 20 a 25 células por campo, lo que nos permite seguir los comportamientos celulares durante la extrusión, al mismo tiempo que resolvemos la dinámica subcelular del actin.

Coloque cuidadosamente una gota de agua sobre el objetivo de 40 aumentos y coloque rápidamente el platillo Mattec encima. Identifique el espécimen utilizando iluminación de campo claro y luego use fluorescencia epiescopia de 488 nanómetros para enfocar específicamente la epidermis positiva para GFP. Cambie al modo de escaneo confocal.

Ajuste la intensidad del láser y el tiempo de exposición para cada uno de los canales de manera correspondiente. Tenga cuidado de equilibrar la potencia del láser y el tiempo de exposición para una detección óptima de su señal y para prevenir cualquier fototoxicidad. Para identificar las células que se extruyen, utilice la fluorescencia epipiluminiscente para visualizar el epitelio marcado con GFP e identifique un grupo de células en un patrón de roseta clásico, que consiste en un conjunto de células que rodean una célula pequeña y redonda en el centro.

Además, debería observarse una acumulación de actina marcada con RFP visible como un anillo alrededor de la pequeña célula redonda en el centro, un signo distintivo de la extrusión celular. Una vez identificada una célula en proceso de extrusión, establezca rápidamente los límites superior e inferior para la serie Z y el tamaño del paso. Luego, comience a adquirir cuatro conjuntos de datos confocales en 4D para visualizar los datos y observar la contracción del anillo de actina y los comportamientos epiteliales que ocurren alrededor de la célula moribunda.

Con el tiempo, realice proyecciones 3D de la serie Z y guarde los datos como un archivo de video. Este paso puede realizarse utilizando una variedad de paquetes de software. Esta figura muestra la expresión de RFP UTR CH en el epitelio de larvas de pez cebra CK GFP de cuatro días post-fecundación.

Aquí se muestran cuadros fijos de proyecciones en el eje Z de una película con lapso de tiempo que sigue la dinámica de la acción en vivo. Durante el proceso de extrusión de células epiteliales, las flechas indican el anillo de actina formado por las células vecinas, el cual se contrae y cierra en el transcurso de dos minutos. Tras seguir este procedimiento, podemos utilizar otros métodos combinados con esta técnica, como el uso de inhibidores químicos o mutaciones genéticas, para comprender mejor cómo la alteración de la extrusión puede conducir a ciertos estados patológicos.

Debido al fracaso en la eliminación de células apoptóticas, acaba de mostrarse cómo configurar un experimento de imágenes de lapso de tiempo para visualizar el proceso de extrusión desde el epitelio de la epidermis del pez cebra en desarrollo. Al realizar este procedimiento, es importante recordar limitar la cantidad de luz a la que se expone la muestra para prevenir cualquier fotobleaching o toxicidad. Eso es todo.

Gracias por ver este video y mucha suerte con sus experimentos.