Placa Sólida basado en la restricción dietética Caenorhabditis elegans

El procedimiento realiza una restricción dietética en la placa estándar basada en agar en *C. elegans* para estudiar su efecto sobre la longevidad, la reproducción y el metabolismo. Esto se logra primero midiendo con precisión la concentración de las bacterias que se utilizarán como fuente alimenticia. El segundo paso del procedimiento consiste en diluir adecuadamente la cultura bacteriana hasta concentraciones adecuadas.

Luego prepare placas SDR con bacterias muertas. Finalmente, establezca experimentos SDR con una población de gusanos sincronizada por edad. Los resultados de la medición de la producción de descendencia y la longevidad pueden mostrar una producción de descendencia retrasada y reducida, así como un aumento en la longevidad media.

La principal ventaja de esta técnica frente a otros 60 métodos como Dian en medio AZA, es que todo el experimento se realizará en un medio sólido estándar basado en AGA que es utilizado por la mayoría de los laboratorios de organismos de sangre caliente para experimentos de restricción dietética, y se deben establecer curvas de calibración separadas para cada cepa bacteriana utilizada como fuente alimenticia. Seleccione una colonia individual de la bacteria e coli OP 50 a partir de una siembra reciente en agar lb e inocule tres mililitros de cultivo líquido de caldo lb en un agitador a 37 grados Celsius durante la noche. Prepare diluciones seriadas al doble de la cultura nocturna.

Luego, mida la absorbancia de cada dilución a 600 nanómetros mediante espectrofotómetro, en tres réplicas. Diluya aún más cada suspensión bacteriana, un millón de veces, y siembre uniformemente 0,4 mililitros de la suspensión bacteriana de cada dilución en una placa de agar LB de 100 milímetros e incube a 37 grados Celsius durante 18 a 24 horas. Cuente el número de colonias bacterianas desarrolladas en cada placa para calcular las unidades formadoras de colonias por mililitro para cada muestra.

Ahora represente gráficamente la DO 600 en función de la concentración bacteriana y realice un análisis de regresión lineal para establecer la relación entre los valores medidos de DO 600 y las concentraciones bacterianas de OP 50. Para este método, se utiliza una concentración bacteriana de 1 × 10¹¹ UFC/mL en la condición de alimentación ad libitum y de 1 × 10⁸ UFC/mL como condición óptima de alimentación con restricción dietaria. Sin embargo, pueden ser necesarias cuatro a seis concentraciones bacterianas diferentes para establecer una relación completa dependiente de la dosis.

Para SDR y sus respuestas. Prepare un inóculo con una colonia individual de bacterias e coli OP 50 en tres mililitros de caldo LB líquido, cultivados en un agitador a 37 grados Celsius durante seis a ocho horas. Transfiera el cultivo de OP 50 a un matraz nuevo que contenga 500 mililitros de caldo LB y cultive durante la noche para que las bacterias alcancen la saturación, si es necesario.

Prepare la dilución adecuada del cultivo OP 50 para la medición de la absorbancia a OD 600. Para determinar la concentración de bacterias, haga un pellet de las bacterias mediante centrifugación a 1500 Gs durante 20 minutos. Retire el sobrenadante y resuspenda las bacterias a una concentración de 1 × 10¹² UFC por mililitro.

Ahora, prepare cultivos bacterianos de 10 mililitros en seis concentraciones diferentes, que varían desde 1 × 10¹² hasta 1 × 10⁷ UFC por mililitro. Pipete 0,2 mililitros del cultivo bacteriano en el centro de una placa N GM solidificada de 60 milímetros. Evite tocar la superficie de la placa con la punta de la pipeta, ya que los arañazos en la superficie permiten que los gusanos se entierren en los agarres.

Coloque las placas en un incubador a 37 grados Celsius durante una hora. Luego, aplique 10 microlitros de carbonic soin al 100 miligramos por mililitro y 10 microlitros de can micina al 50 miligramos por mililitro a cada placa para detener el crecimiento de las bacterias. Almacene las placas con diferentes concentraciones de antibiótico que mataron bacterias a cuatro grados Celsius para su uso futuro durante un período de hasta un mes.

Es importante preparar y almacenar suficientes placas, preferiblemente del mismo lote para toda la planta. Realice el experimento al menos uno o dos días antes para verificar la viabilidad de las bacterias. Raspe algunas bacterias de las placas SDR y extiéndalas sobre una placa N GM vacía con carbónico, sein y antimicina.

Coloque la placa en un incubador a 37 grados Celsius durante seis a ocho horas y confirme la ausencia de crecimiento bacteriano. Para la mayoría de los estudios relacionados con SDR, como el análisis de longevidad y el perfilado de la producción de descendencia, es esencial la preparación de una población de gusanos sincronizada por edad. Utilice un recolector de gusanos de platino para transferir de 20 a 30 adultos reproductivamente activos a varias placas NGM regulares.

Con OP 50. Dependiendo del número de huevos necesarios para los experimentos, puede que se requieran más adultos. Deje las placas a 20 grados Celsius durante cuatro horas para permitir la puesta de huevos.

Retire los adultos de la placa e inspeccione visualmente las placas en busca de huevos. Continúe incubando las placas a 20 grados Celsius para permitir que la descendencia se desarrolle hasta la etapa de adulto del día uno tardío L4. Por lo general, esto tarda tres días para gusanos silvestres N2 a 20 grados Celsius.

Para el análisis de longevidad. Transfiera 10 a 12 gusanos adultos del día uno a una placa SDR para iniciar la restricción dietética. Para obtener suficiente potencia estadística, utilice un total de 60 a 100 gusanos para cada condición de SDR.

Puntúe la viabilidad de cada gusano cada dos o tres días hasta que todos los gusanos hayan muerto. Es importante transferir los gusanos a placas SDR frescas cada dos días para evitar el ayuno. Esta curva de calibración representa la concentración de OP 50 en relación con la DO 600.

La ecuación generada por el análisis de regresión lineal puede utilizarse para todos los cálculos futuros de concentraciones bacterianas de OP 50. Este estudio analiza el efecto de tratamientos crónicos con SDR sobre la longevidad media de diferentes cepas de gusanos en comparación con la respuesta dependiente de la dosis normal de gusanos de tipo salvaje frente a SDR. El efecto de SDR sobre la longevidad es parcialmente suprimido por la sobreexpresión de DR dos, mientras que la mutación DAF 16 MU 86 no tiene efecto sobre la extensión de la longevidad inducida por SDR.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar Dian en la partida estándar de AGA basada en la elegancia marina.