Protocolo optimizado para la transfección eficiente de células dendríticas, sin maduración de las células

El objetivo general de este procedimiento es reducir la expresión del gen diana en DCS mediante la transfección con ARNip. Esto se logra primero programando el efector AM Maxin Nucleo. El segundo paso del procedimiento consiste en mezclar DCS y ARNip juntos y pipetear la solución celular resultante en los módulos Nucleo QVE.

El tercer paso del procedimiento consiste en colocar la placa en la bandeja del shuttle amaxa para iniciar el proceso de transfección. El paso final del procedimiento es infectar las células con el virus para activar la respuesta de interferón. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren la inhibición génica mediante R-T-P-C-R cuantitativa y transferencia Western.

Esta técnica es valiosa para caracterizar vías de señalización en células dendríticas y puede contribuir al desarrollo de terapias inmunitarias basadas en células dendríticas. Para programar el nucleofactor Maxon de placa de 96 pocillos para la transfección de DC, abra un nuevo archivo de parámetros. Seleccione el número de pocillos que utilizará para la transfección estándar arrastrando el cursor sobre el diagrama de la placa de 96 pocillos.

Utilice un mínimo de tres pocillos para agrupar cada muestra experimental. Ahora ingrese el código del programa en la parte uno, seleccione F, F y en la parte dos, seleccione 1 68 en los menús desplegables. Luego, en el cuadro de solución, seleccione monocito humano; a continuación, en la opción de control, seleccione estándar y luego haga clic en aplicar.

Para incluir un control sin transfección, es necesario seleccionar pozos adicionales del diagrama. Luego, en la opción de control, elija control sin programa y haga clic nuevamente en aplicar. Después de mezclar la solución de nucleofección, déjela calentar a temperatura ambiente.

Coloque el número de módulos nucleo vete necesarios en la placa nucleo VETE en la orientación correcta, como se muestra aquí, insertando el primero en las posiciones uno y dos de color rosa, y luego así sucesivamente con todos los tubos siguientes. Transfiera suficiente DCS desde un frasco de cultivo celular a un tubo de 50 mililitros para obtener 500.000 células por pocillo para la transfección; centrifugue las células durante 10 minutos a 400 G a cuatro grados Celsius y luego retire cuidadosamente el sobrenadante. A continuación, agregue la solución de afectación nuclear al tubo y luego resuspenda el DCS pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo varias veces.

Ahora etiquete los tubos eppendorf DPH según el tratamiento específico que se realizará, y luego divida las células resuspendidas en los tubos etiquetados. Añada ARNsi a una concentración final de 0,25 microgramos por 500.000 células a los tubos eppendorf correspondientes, y luego mezcle las suspensiones celulares mediante pipeteo. Utilice ARNsi no dirigido para la muestra de control sin transfección.

Luego, pipetee 20 microlitros de la suspensión de células SI RA DC en los módulos nucleo vete según el diseño experimental programado previamente, asegurándose de que el líquido se entregue al fondo del pocillo. Cubra la placa nucleo vete con una tapa y golpee suavemente la placa sobre una superficie dura varias veces para facilitar la eliminación de burbujas de aire para transfectar los dc. Inserte la placa nucleo Yvette preparada en la bandeja shuttle de 96 pocillos nucleo effector. A continuación, haga clic en el botón de carga e inicio.

Siga el progreso del proceso de transfección en la pantalla. Una cruz negra sobre un fondo verde indica una transfección exitosa en ese pocillo, mientras que una barra negra sobre un fondo rojo significa que fue infructuosa mientras las células están siendo transfectadas. Precaliente el medio de crecimiento para DC al finalizar el proceso de transfección, retire la placa y agregue 80 microlitros del medio de crecimiento para DC precalentado a cada pocillo.

Utilizando una pipeta multicanal, incube ahora la placa durante 10 minutos a 37 grados Celsius y 5% CO₂. Durante el período de incubación, agregue 100 microlitros del medio de crecimiento DC precalentado a los tubos matriz en la misma orientación que el arreglo de la placa de cubetas nucleo. Tras el período de incubación, transfiera los 100 microlitros completos de las suspensiones celulares desde las cubetas nucleo CVE a los tubos matriz previamente dispuestos.

Luego retire y deseche los tubos en los que no ocurrió la transfección. Finalmente, incube los tubos de matriz durante 24 horas u otro intervalo de tiempo deseado. Etiquete los tubos einor para cada uno de los tubos de matriz en incubación.

Luego, transfiera los tubos de matriz del incubador a una campana de cultivo celular y reúna los tubos de matriz para cada muestra experimental en los eend dfs previamente etiquetados. A continuación, sedimente suavemente las células girando los tubos eend DPH en una centrífuga de banco durante 10 minutos a 400 G, retire el sobrenadante y re suspenda las células en medio de crecimiento sin suero que contenga el virus de la enfermedad de Newcastle o NDV a una MOI de uno aproximadamente.

Cubra los epiendorfinas de forma estéril y luego incube los tubos durante 45 minutos. Después de este período de incubación, agregue 900 microlitros de medio de crecimiento DC y vuelva a incubar los tubos durante otras ocho a 10 horas. Para recolectar las DC transfectadas e infectadas.

Se pelletizaron las células mediante centrifugación de los tubos einor en una centrífuga de sobremesa como antes y se eliminó el sobrenadante. Los monocitos dcs fueron transfectados con ARNi dirigido contra RIG I o con ARNi luminiscente no específico e infectados con NDV, como indica un signo positivo, o permanecieron no infectados, como indica un signo negativo, según se detectó mediante R-T-P-C-R-A cuantitativa. Se observó una reducción del 75 % en la transcripción de R RGA. A nivel de transcripción, se observó una reducción similar en la expresión del interferón beta. También se observó la expresión de un efector downstream de RGA en la cascada de señalización del interferón. Además, la expresión de interferón beta en las células control no infectadas y transfectadas no fue detectable.

Mientras que la de MXA y del gen de respuesta downstream del interferón beta fue mínima. Aquí se muestran los datos de una segunda transfección de DCS con ARNi dirigido a RIG-I realizada como en la figura anterior. Sin embargo, todas las células están infectadas con NDV y se incorporó un control adicional utilizando DCS de monocitos no resecados.

Los resultados de silenciamiento génico fueron similares a los observados en la figura anterior. Un inmunotransferencia reveló que la expresión proteica de este gen había sido completamente bloqueada. Las calles uno y dos muestran datos de lisados de células no resecadas.

Las calles tres y cuatro muestran lisados de células transfectadas con ARNi de luciérnaga, y las calles cinco y seis muestran lisados de células transfectadas con ARNi dirigido contra RIG I. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en una hora, incluyendo la inhibición simultánea de muchos genes.