Determinación de estructuras moleculares de glicoproteínas de la envoltura del VIH con Cryo-tomografía electrónica y automatizada promedio Sub-tomografía

Más de 60 millones de personas han sido infectadas con el VIH, el virus que causa el SIDA. El VIH-SIDA es una crisis de salud global, y aunque los esfuerzos intensivos de investigación han prolongado dramáticamente la vida de las personas infectadas, una vacuna verdadera sigue siendo esquiva. Un enfoque principal de la investigación de vacunas contra el VIH es la glicoproteína de envoltura, que el VIH utiliza para entrar en las células diana.

En este vídeo, demostramos cómo obtenemos estructuras de esta importante proteína mediante una técnica de imagen llamada tomografía electrónica criogénica. A partir del VIH purificado, mostramos los pasos en la preparación de muestras congeladas, los pasos en la obtención de imágenes microscópicas electrónicas a partir de estas muestras congeladas y los pasos para convertir estas imágenes en modelos estructurales que podrían ser útiles para el diseño de vacunas contra el VIH/sida. Un aspecto único de lo que presentamos en este vídeo es que el trabajo será demostrado por miembros de su laboratorio que abarcan un amplio rango de edades, desde estudiantes de secundaria y preparatoria hasta estudiantes universitarios y de posgrado, así como investigadores postdoctorales y científicos senior.

La preparación de muestras víricas vitrificadas adecuadas para la tomografía electrónica criogénica se logra extendiendo una suspensión acuosa de virus sobre pequeños orificios en una película de carbono soportada por una rejilla de cobre, y luego congelando rápidamente los virus. El objetivo de este paso es preparar un espécimen congelado de virus intactos capturados en un estado cercano al natural. Para comenzar, las rejillas se colocan dentro de una unidad de descarga por resplandor.

Este dispositivo limpia las rejillas exponiéndolas a un gas ionizado. Ahora que las rejillas están listas para su uso, se prepara una suspensión de virus mezclada con pequeñas partículas de oro. Estas partículas son esenciales para la recopilación y el procesamiento de datos.

A continuación, se coloca una gota de suspensión vírica sobre la rejilla recién limpiada con plasma. Luego, la rejilla se carga en un robot, que la secarrolla con papel de filtro, reduciendo la gota a una película delgada de líquido. La muestra se sumerge entonces en etano líquido, que congela rápidamente los virus a una velocidad superior a 100.000 kelvin por segundo.

La rejilla con congelación por inmersión se transfiere entonces a una caja de almacenamiento para su transporte al microscopio. Este procedimiento se repite hasta que se hayan congelado el número deseado de rejillas. Ahora que las rejillas con muestras de virus están listas, el siguiente paso consiste en cargarlas en el microscopio.

Para la obtención de imágenes, esto puede hacerse manualmente o con ayuda robótica. Cuando las rejillas de muestra se cargan manualmente, el usuario se sienta en una estación especializada donde las muestras pueden manipularse bajo nitrógeno líquido; las muestras se colocan en una cámara portátil refrigerada con nitrógeno que se sella, se vacúa y luego se conecta al microscopio. Los microscopios más recientes son capaces de cargar muestras de forma más automatizada.

Aquí, en un microscopio Titan Cryos, el usuario entrega muestras congeladas al microscopio, que luego se cargan de forma robótica con las rejillas de muestra colocadas en el microscopio. Cada rejilla puede ser examinada por el usuario antes de iniciar la adquisición de imágenes. Los parámetros del microscopio se configuran para cada área de la rejilla de muestra que contenga características de interés.

En este caso, las características son virus del VIH. A medida que se define cada nueva área, el ordenador del microscopio almacena los parámetros de imagen específicos del área. Cuando el usuario ha definido todas las posiciones de interés, el ordenador vuelve automáticamente a cada posición y recopila un conjunto de datos.

Cada conjunto de datos se recopila inclinando la rejilla de muestra con respecto al haz de electrones, asegurando al mismo tiempo que el haz permanezca enfocado en el mismo punto de la rejilla. Tradicionalmente, la recopilación de datos en microscopía electrónica ha requerido que los usuarios permanezcan en el microscopio e interactúen físicamente con el equipo. Este tipo de interacción con el microscopio se muestra aquí durante una visita del presidente Obama a una fábrica de Intel.

Los recientes avances en las interfaces informáticas de microscopios ahora permiten a los usuarios supervisar y ajustar la recopilación de datos en tiempo real desde un ordenador remoto en el laboratorio o desde otro lugar. Para visualizar las formas del envoltorio y de las espigas de glucoproteínas, es necesario promediar la información procedente de cientos de imágenes individuales con el fin de aumentar la señal. Este es un proceso que requiere una gran capacidad computacional, que aquí se lleva a cabo mediante un grupo de ordenadores denominado Bio Wolf.

Situado en los NIH, se han desarrollado métodos potentes para extraer volúmenes individuales y promediar la información mediante algoritmos capaces de funcionar a niveles de ruido elevados. Intrínsecos a este tipo de datos, los mapas de densidad obtenidos tanto de virus nativos como de virus complejados con moléculas biológicamente importantes proporcionan una base de datos rica en información sobre la biología estructural del VIH. Los mapas de densidad cobran vida con detalle molecular cuando los datos se combinan con la información proveniente de la cristalografía de rayos X de las subunidades individuales que componen la espiga de la glucoproteína de envoltura.

Los datos que se obtienen de estas tomografías pueden ser muy densos y difíciles de interpretar. Se puede utilizar software 3D de la industria del entretenimiento para visualizar los modelos tridimensionales añadiendo colores, texturas e iluminación, lo que facilita su análisis. El software de visualización comúnmente utilizado incluye Mirror 3D Studio Max y Maya.

Acabamos de demostrar procedimientos paso a paso sobre cómo se pueden obtener modelos moleculares para la estructura de la envoltura. Glicoproteína, a partir del VIH purificado. Mediante este método, también hemos determinado estructuras de la glicoproteína de la envoltura en complejo con una variedad de moléculas que pueden unirse y aprovechar el virus.

Aquí mostramos un ejemplo de la estructura de la glucoproteína de envoltura en complejo con un anticuerpo denominado B12. Comprender por qué algunas moléculas pueden unirse y utilizar el virus mientras que otras no, es muy importante para el diseño racional de vacunas. Determinar las estructuras moleculares de las glucoproteínas de envoltura del VIH o de otros virus, como la influenza y el Ébola, es fundamental para entender la entrada y utilización viral.

Como ha podido observar, la tomografía crioelectrónica está emergiendo ahora como una herramienta poderosa para lograr este objetivo.