Cuantificar la frecuencia de tumores se propagan las células usando trasplante de células limitación de dilución en el pez cebra singénico

El ensayo de trasplante de células por dilución límite es el estándar de oro para evaluar el potencial de autorrenovación en modelos animales experimentales. En esta demostración, embriones de pez cebra singénicos en estadio de una sola célula son inyectados con rag dos MIC y RAG dos GFP para generar peces cebra transgénicos que desarrollarán leucemia linfoblástica aguda T marcada con fluorescencia. A los 60 días de vida, las células leucémicas primarias se aíslan del pez cebra y luego se purifican mediante clasificación fluorescente de células activada.

A continuación, las células se trasplantan por dilución límite en la cavidad peritoneal de peces cebra adultos, y se monitorea el crecimiento tumoral en los peces durante un período de hasta 90 días. Finalmente, se utiliza el programa estadístico de análisis de dilución límite extrema para cuantificar la frecuencia de células que propagan la leucemia dentro del tumor original. El análisis de trasplante de células por dilución límite permite a los investigadores evaluar con precisión el número de células con capacidad de autorrenovación presentes en la masa tumoral total.

Son estas células autorrenovables las que impulsan la formación del cáncer y son finalmente responsables de la recaída. La principal ventaja de realizar ensayos de trasplante por dilución límite en el modelo de pez cebra es que se pueden trasplantar muchos peces por cada experimento, lo que resulta en una mayor precisión al determinar la frecuencia de células tumorales propagadoras con capacidad de autorrenovación. Este método proporciona información sobre las células tumorales propagadoras en la leucemia linfoblástica aguda de células T.

También puede aplicarse para comprender otros modelos de cáncer en pez cebra. Jessica Blackburn, investigadora en el laboratorio, y Sally Liu, una técnica talentosa, demostrarán el procedimiento para ustedes hoy. Para linealizar los constructos Rag2 CM y RAG2 GFP DNA, digiera 10 microgramos de cada plásmido con la enzima de restricción NotI a 37 grados Celsius durante la noche. Después de la extracción con fenol-cloroformo y la precipitación con etanol, suspendemos cada plásmido en 20 microlitros de agua.

Determine las concentraciones de ADN en un gel de agarosa al 1 % realizando una dilución uno a uno, uno a cinco y uno a 10 de cada plásmido digerido con 20 microlitros, 10 microlitros y cinco microlitros de una escalera de ADN de rango alto. Ahora diluya el ADN hasta una concentración final de 60 nanogramos por microlitro para inyección en la cepa CG uno de syngen. Inyecte 250 nanolitros de 30 nanogramos por microlitro de rag dos CM y 30 nanogramos por microlitro en embriones de pez cebra.

Inyecte dos copias de GFP en embriones de pez cebra de una sola célula, dirigiendo cuidadosamente el ADN directamente hacia la célula y no hacia la yema. Almacene los embriones inyectados a 28,5 grados Celsius y retire los embriones muertos después de 24 horas; a los cinco días de vida, transfiera los animales a tanques grandes aproximadamente 28 días después de la inyección. Anestesie larvas de pez cebra añadiendo 200 microlitros de tricaína a cuatro nanogramos por mililitro a 25 mililitros de agua del sistema para peces en una placa de Petri.

Examine las larvas en busca del desarrollo de TALL marcado con fluorescencia utilizando un microscopio de epifluorescencia para detectar la fluorescencia de GFP. Separe las larvas positivas para el tumor de las negativas para asegurar que ningún pez leucémico se pase por alto en el análisis. Las larvas negativas pueden examinarse en un momento posterior una vez que los tumores puedan haber crecido más. Monitoree los peces leucémicos marcados con fluorescencia al menos una vez por semana utilizando el microscopio de epifluorescencia para seguir el crecimiento del tumor.

Cuando las células leucémicas positivas para GFP hayan invadido más del 50 % del animal, añada un mililitro de cuatro nanogramos por mililitro de Trica S en una placa de Petri que contenga nueve mililitros de agua de sistema para peces para sacrificar al pez; coloque el pez en una nueva placa de Petri que contenga un mililitro de suero bovino fetal al 5 % en PBS 0,9 X. Macece el pez con una hoja de bisturí y pipetee la mezcla para disociar los grandes agregados celulares. A continuación, pase las células a través de un filtro de malla de 40 micrómetros hacia un tubo de 50 mililitros.

Pipetee 500 microlitros de las células en un tubo de poliestireno de cuatro mililitros. Añada un microlitro de yoduro de peridinio al miligramo por mililitro para marcar las células muertas, vortexee y luego mantenga las células en hielo. Prepare también un pez tipo salvaje CG uno para recolectar células sanguíneas normales, que sirven como vehículo para las células tumorales durante el trasplante, agregue cuatro mililitros de FPS al 5% en PBS 0,9 X al tubo de 50 mililitros para un volumen total de cinco mililitros.

Cuente las células sanguíneas normales diluidas hasta tres veces 10 a la quinta células por mililitro en FBS al 5 % en PBS 0,9 x, luego pipetee 100 microlitros por pocillo en una placa de 96 pocillos utilizando un citómetro de flujo para clasificar las células tumorales GFP positivas y PI negativas dentro de la placa de 96 pocillos que contiene células sanguíneas en las dosis indicadas. Adicionalmente, clasifique 10.000 células en un pocillo sin células sanguíneas normales y vuelva a analizar mediante citometría para evaluar la pureza y viabilidad de las células clasificadas. Centrifugue la placa de 96 pocillos a 2000 ×g durante 10 minutos para formar el sedimento celular.

Retire 95 microlitros del sobrenadante y resuspenda las células en los cinco microlitros restantes. Inyecte la suspensión celular en la cavidad peritoneal de peces cebra adultos sinnégenos de más de 60 días de edad utilizando una microjeringa de calibre 26 y medio. No es necesario anestesiar a los peces cebra antes del trasplante.

Trasplante 45 peces con 10 células leucémicas, 20 peces con 100 células, siete peces con 1000 células y cinco peces con 10,000 células TALL aproximadamente 28 días después del trasplante. Examine los peces receptores con un microscopio de fluorescencia episcópica utilizando una longitud de onda de excitación de 485/20 y un filtro de emisión de 530/25 para detectar la fluorescencia de GFP.

Registre el número de peces positivos por cada número total de peces inyectados. Vuelva a examinar los peces cada 14 días durante un período de hasta 90 días y registre el número de peces positivos. Cuando un pez con tumor positivo se vuelva más abundante.

Sacrifique al animal mediante sobredosis de trica US, introduzca los resultados en una tabla y cargue los datos en el software web de análisis de dilución límite extrema para determinar la frecuencia de células leucémicas con autorrenovación dentro de los embriones primarios de TALL CG. Un linaje fue inyectado con RAG dos cmic y las larvas RAG dos GFP fueron seleccionadas para TALL primario. Después de 28 días, de acuerdo con trabajos previos, aproximadamente el 5 % de los peces inyectados presentan linfocitos T GFP positivos dentro de su timo, y el 100 % de estos peces desarrollarán leucemia. Aquí, células TALL marcadas con fluorescencia fueron clasificadas a partir de animales enfermos de 65 días de edad y utilizadas en el ensayo de trasplante celular por dilución límite. Primero, se trazó una compuerta para seleccionar células individuales.

Luego se seleccionaron las células negativas para yoduro de propidio. Y finalmente se trazó un portal para seleccionar únicamente las células leucémicas positivas para GFP destinadas a la clasificación. En este ejemplo de peces trasplantados con LLA en el día 28, se observaron tumores en estadio temprano como una zona de células positivas para GFP cerca del sitio de inyección.

Aunque algunos TLS estaban más avanzados, ya expandidos para llenar la cavidad peritoneal en estos experimentos, se trasplantaron más de 220 animales, lo cual puede realizarse fácilmente por una persona en varias horas. El análisis de datos mediante el software elda mostró que, en promedio, una de cada 135 células T era una célula propagadora de leucemia con capacidad de autorrenovación. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo trasplantar células tumorales en dilución limitante a la cavidad peritoneal de peces cebra singénicos, y de cómo utilizar los datos resultantes para determinar la frecuencia de células propagadoras de tumores dentro de un tumor determinado.

Estudios posteriores que utilicen animales modificados genéticamente podrían ayudar a identificar los mecanismos que regulan la autorrenovación de estas células propagadoras de tumores.