Mosaico de Análisis de la función de genes en el desarrollo postnatal del cerebro del ratón mediante el uso de virus basada en la recombinación Cre

El objetivo general de este procedimiento es manipular la función génica durante el período posnatal del desarrollo cerebral. Esto se logra primero seleccionando y preparando los virus adecuados, cargándolos en la jeringa y preparando el equipo de inyección. Luego, se inyecta el virus en los cerebros de crías recién nacidas de ratón, y el paso final consiste en sacrificar a los animales e imaginar las regiones inyectadas.

Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran una marcación diferencial de células control y células knockout mediante microscopía de inmunofluorescencia. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la neurociencia, como cómo se regula genéticamente el período de desarrollo postnatal. Para la inyección, se puede utilizar una solución comercial de virus adenoasociado con un título completo, típicamente de 10 a la 12.ª copia genómica por mililitro, para manipular un gran número de células.

Si se desea una etiquetado escaso o diluido, comience con una dilución de uno a diez. Después de descongelar el virus en hielo, transfiera inmediatamente el volumen de pre-dilución a un tubo estéril de PCR de 250 microlitros. Mantenga la dilución en hielo ahora.

Prepare la bomba de inyección seleccionando una jeringa adecuada y conéctela a una aguja de carga. A continuación, aspire suavemente la solución vírica hasta que se observe una burbuja de aire muy pequeña en la jeringa; se puede utilizar un colorante inerte de carga para facilitar este paso. Ahora sujete la jeringa a la bomba con un sujetador.

Luego, conecte suavemente el tubo de conexión entre la jeringa y el portaagujas. Asegúrese de que la aguja de inyección esté en contacto directo con el tubo de conexión dentro del portaagujas. Ahora, pase lentamente la solución a través del tubo de conexión hasta que una pequeña gota de solución sea visible en la punta de la aguja.

Asegure cuidadosamente el émbolo junto al bloque empujador con un soporte en la bomba. Establezca la velocidad de inyección en ocho microlitros por minuto y ajuste el volumen de inyección entre uno y dos microlitros. Luego, regule el diámetro de la jeringa en la configuración de la bomba para que coincida con el diámetro de la jeringa que está utilizando.

Por último, para proteger a las crías durante la fase de recuperación, ajuste la placa calefactora a 38 grados Celsius y cúbrala con una toalla de papel. Siguiendo un protocolo aprobado por el IACUC, prepare crías de ratón P cero o P uno para la inyección sometiéndolas a anestesia por frío. Humedezca algunas toallas de papel con agua y colóquelas sobre hielo.

Luego, coloque cuatro o cinco crías sobre la toalla de papel bien separadas. Doble suavemente la toalla de papel sobre las crías, coloque una pequeña cantidad de hielo picado encima de la toalla y incube las crías durante aproximadamente cinco minutos. Las crías pueden mantenerse de forma segura sobre hielo hasta 15 minutos y aún así recuperarse adecuadamente.

Ahora coloque un cachorro anestesiado sobre un bloque de sujeción para obtener el mejor acceso al sitio de inyección. Por ejemplo, la corteza se accede más fácilmente colocando al animal tumbado boca abajo. El cachorro puede fijarse en su lugar usando una tirita, estabilice manualmente la cabeza del cachorro y tense la piel para evitar que se mueva.

Luego, siga los puntos de referencia anatómicos del cráneo, como la sutura lambda, y seleccione con la otra mano un punto de inyección reproducible; inserte suavemente la aguja a través del cráneo. No ejerza presión si la aguja no penetra fácilmente el cráneo. En cambio, reposicione la aguja e intente nuevamente con suavidad.

La profundidad de inyección varía ligeramente entre animales y cepas individuales para la corteza; generalmente, funciona una profundidad de medio a un milímetro. A continuación, inyecte la solución viral haciendo que un colega active la bomba para minimizar los movimientos de la mano. Idealmente, se podría usar un pedal con el pie para encender la bomba después de la inyección.

Mantenga la aguja en su lugar durante unos segundos, luego, manteniendo la cabeza del cachorro quieta, retire suavemente la aguja. Ahora, permita que el cachorro se recupere durante cinco a 10 minutos sobre la placa caliente cubierta.

Durante este tiempo, continúe inyectando a las demás crías. Cuando todas las crías hayan recuperado su color rosado y estén moviéndose, frótelas suavemente con una porción de la cama de su hogar. Solo entonces pueden devolverse a su madre.

De lo contrario, podrían ser tratados como crías desconocidas, las cuales la madre muy probablemente mataría después de que las crías hayan sido devueltas a ella. Limpie el equipo de inyección cargando completamente la jeringa con acetona o etanol al 70 %. Si se utilizan componentes sensibles a la acetona, como sano, acurate o adhesivos, pase la solución a través del equipo de inyección varias veces usando solución fresca cada vez.

Esto eliminará cualquier solución de virus remanente y los precipitados, y los disolventes se evaporarán. Después de lavar el montaje, desinfecte el área de trabajo con lejía para dejarla lista para el próximo experimentador. Mentor. La técnica exitosa produce una infección neuronal robusta en el sitio de inyección.

Las inyecciones en regiones específicas, como la corteza y el colículo superior, suelen generar infecciones locales con mínima diseminación a regiones adyacentes. El uso de una solución vírica de alto título hace más probable la infección de áreas adyacentes, como el hipocampo, en comparación con la inyección con una solución vírica de bajo título. Los resultados muestran una infección dispersa, típicamente cerca del sitio de inyección; por ejemplo, en la inyección cerebelosa en la línea media, el número de células infectadas debería correlacionarse con el título de la solución vírica inyectada.

Por ejemplo, inyectar una mezcla de soluciones de alto título de dos virus AAV8 que expresan proteínas fluorescentes diferentes en el cerebelo infecta muchas células kinji que están marcadas diferencialmente. Por el contrario, inyectar una solución viral de bajo título puede resultar en una infección dispersa que facilita la visualización de células individuales. Las neuronas marcadas con fluorescencia se pueden observar directamente en tejido fresco recién cortado, o se pueden someter a inmunotinción.

Esto potencia las señales fluorescentes endógenas para la adquisición posterior de imágenes mediante microscopía fluorescente de campo amplio o confocal. Por último, el RAAV ocho es capaz de infectar una variedad de tipos de neuronas en la corteza con una marcación intensa de los procesos finos. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente 30 minutos si se lleva a cabo adecuadamente.