Preparación, purificación y caracterización de los complejos lantánidos para el uso de agentes de contraste para resonancia magnética

El objetivo general de este procedimiento es sintetizar, purificar y caracterizar complejos que contienen lantánidos y que pueden utilizarse para marcar macromoléculas biológicas. Esto se logra primero mezclando el material inicial metálico y el ligando mientras se controla el pH de la solución. El segundo paso del procedimiento consiste en purificar el complejo resultante mediante diálisis.

A continuación, se debe verificar la ausencia de metal libre. El paso final del procedimiento es la caracterización de las propiedades del complejo que son relevantes para la obtención de imágenes. Finalmente, se pueden obtener resultados que demuestran que los complejos sintetizados actuarán como agentes de contraste mediante mediciones de actividad relajante.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la imagenología, como si el número de coordinación de agua de un agente de contraste cambia al unirse a una proteína. En general, las personas que necesiten este método tendrán dificultades porque no controlar cuidadosamente el pH hará que el LI sea inútil para la educación en biología. La demostración de las mediciones de diálisis y actividad estará a cargo de Buda y Sashi.

Los estudiantes de posgrado de mi laboratorio Para comenzar la metación utilizando sales de lantánido, primero disuelva un equivalente de ligando en agua para producir una solución de 30 a 265 milimolares. Aquí se utiliza el ligando Paraiso Benzyl DTPA a una concentración de 73 milimolares. A continuación, ajuste el pH de la solución de ligando entre 5,5 y siete añadiendo hidróxido de amonio 1 molar.

En este video, se utilizan ahora 0,2 mililitros de la solución de hidróxido de amonio uno molar para disolver uno o dos equivalentes de cloruro de lantánido en agua y producir una solución con una concentración de cinco a 1000 milimolares. Se puede usar cloruro de europio o cloruro de gadolinio en concentraciones de 111 milimolares. A menudo se utiliza un exceso de metal para impulsar la reacción hasta su finalización y, en consecuencia, simplificar la purificación.

A continuación, agregue cada solución de sales de lantano a la solución preparada del ligando bajo agitación. Ahora ajuste el pH de las mezclas reaccionantes resultantes entre 5,5 y siete mediante la adición de hidróxido de amonio 0,2 molar. Aquí, se utiliza un volumen total de 0,5 mililitros de la solución de hidróxido de amonio 0,2 molar para ajustar la solución.

Si el ligando que se está utilizando contiene grupos funcionales sensibles al ácido, ajuste el pH varias veces durante este paso. Tenga cuidado al ajustar el pH, ya que si la solución se vuelve demasiado básica, los grupos funcionales sensibles a la base, como el isotiocianato, quedarán inutilizables. Para la conjugación, supervise cuidadosamente la reacción mediante mediciones de pH.

La reacción está completa cuando el pH permanece constante. Para ligandos que no tienen grupos funcionales sensibles a la base, un trabajo posterior que implique elevar el pH también puede ser útil. Para comenzar el trabajo posterior por diálisis, determine una longitud adecuada de tubo de diálisis para contener el volumen de la muestra más una longitud adicional para alojar un 10 % adicional del volumen de la muestra. Luego, siga las instrucciones del fabricante para cortar el tubo a esta longitud.

En este video, se utilizó una membrana con un límite de peso molecular de 100 a 500 Dalton, pero puede usarse tubo con un límite de peso molecular mayor, según sea apropiado, si la conjugación se realiza antes de la metilación. Si es adecuado y según las indicaciones del fabricante, remoje el tubo de diálisis cortado en agua durante 15 minutos a temperatura ambiente. A continuación, llene un recipiente de diálisis con agua, que servirá como dializado. Aquí se utiliza un vaso de precipitados de un litro.

El volumen del dializado debe ser aproximadamente 100 veces mayor que el de la muestra. Ahora doble un extremo del tubo dos veces y asegure la parte doblada con la abrazadera de cierre para diálisis. Envuelva el extremo de la abrazadera con una banda elástica para asegurarse de que permanezca cerrado durante la diálisis.

Filtre la mezcla de reacción previamente preparada a través de un filtro de 0,2 micrones. Luego cargue el filtrado en el extremo abierto del tubo, teniendo cuidado de no romper el tubo.

Asegúrese de dejar suficiente espacio libre para cerrar el tubo. Doble dos veces el extremo abierto restante del tubo, luego asegúrelo con un cierre y envuelva el cierre con una banda de goma. A continuación, sujete un vial de vidrio que contenga aire a la abrazadera en un extremo del tubo de diálisis utilizando otra banda de goma.

Luego, sujete un vial que contiene arena al otro sujetador. Estos viales garantizan que el tubo permanezca sumergido en el dializado. Ahora, coloque el tubo completo en el depósito de diálisis que contiene el dializado.

Agite el dializado utilizando una placa magnética de agitación a baja velocidad a temperatura ambiente. Asegúrese de que la velocidad de agitación permanezca lenta y de que la solución no vortex. Cambie el dializado tres veces durante el transcurso de un día.

En este video, el dializado se cambia a las 2,5, 6,5 y 11,5 horas. Permita que la diálisis continúe durante la noche durante un total de 20 a 28 horas. Una vez completada la diálisis, retire el tubo del dializado y abra cuidadosamente un cierre para extraer la muestra.

Lave el tubo de diálisis tres veces con agua y combine los lavados con la muestra. Finalmente, elimine el agua de la muestra bajo presión reducida aquí. Esto se logra mediante liofilización.

La muestra se congela y luego se coloca en un aparato de liofilización. Para evaluar la presencia de metal libre en la muestra, primero prepare un tampón acetato disolviendo 1,4 mililitros de ácido acético en 400 mililitros de agua, ajuste el pH a 5,8 con hidróxido de amonio 1 M y agregue agua hasta obtener un volumen total de 500 mililitros. Luego, disuelva 0,3 miligramos de cada complejo en 0,3 mililitros de tampón.

Ahora prepare el indicador naranja de xol, que debe tener una concentración de 16 micromolar en el tampón de pH 5,8. Añada tres mililitros de esta solución indicadora a los complejos metálicos disueltos previamente. Detecte la presencia de metal libre mediante la observación del cambio de color del indicador, de amarillo a violeta.

Si se desea, se puede cuantificar la cantidad de metal libre mediante la elaboración de una curva de calibración. Si queda metal libre, la muestra debe purificarse adicionalmente mediante diálisis o cromatografía líquida de alta eficacia antes de la caracterización. A continuación, para determinar el número de coordinación con agua de una muestra de opio, prepare una solución de aproximadamente un milimolar del complejo que contiene opio en agua, y luego otra solución de la misma concentración en óxido de deuterio.

Antes del análisis, la solución de óxido de deuterio debe evaporarse y disolverse en óxido de deuterio tres veces para eliminar el agua residual, encender el espectrofluorímetro, agregar la solución acuosa a una vete limpia y colocar la vete en el espectrofluorímetro. A continuación, realice las mediciones de excitación y emisión para determinar los máximos de cada una a aproximadamente 395 nanómetros y 595 nanómetros, respectivamente. Luego, realice un experimento de decaimiento temporal de fosforescencia utilizando las longitudes de onda de excitación y emisión recién determinadas y los parámetros mostrados aquí.

Repita este paso con una solución preparada de óxido de deuterio. A partir de los datos de decaimiento de luminiscencia recién obtenidos, trace el logaritmo natural de la intensidad frente al tiempo. La pendiente de estas líneas corresponde a las tasas de decaimiento. En este video, se utilizó Microsoft Excel 2007 para generar las gráficas del logaritmo natural a partir de los datos brutos.

Utilice las tasas de decaimiento en la ecuación desarrollada por Hors y colaboradores que se muestra aquí. Si su ligando contiene grupos OH o NH coordinados al metal, entonces la ecuación debe modificarse antes de su uso. Para determinar las mediciones de relajación de la muestra primero, seleccione el modo de aplicación deseado en el analizador de tiempos de relajación, ya sea T uno o T dos.

Aquí se selecciona el ajuste T uno. A continuación, prepare una serie de muestras que contengan diferentes concentraciones del complejo que incluye lantánido en un disolvente acuoso. Aquí se utiliza agua como disolvente y soluciones de diez cinco dos 0.5, 1.25, 0.625 y cero.

Se preparan milimolares. Se pueden utilizar otros disolventes o tampones, pero es importante usar el disolvente como blanco. El volumen final de la muestra depende del instrumento que se esté utilizando.

Coloque una muestra en el instrumento y déjela reposar durante cinco minutos para que se equilibre a la temperatura del instrumento, que es de 37 grados Celsius para la unidad utilizada en este video. Ahora determine el tiempo de relajación en unidades de segundos ajustando los parámetros del software para obtener una curva exponencial suave para T uno o T dos. Repita este procedimiento para todas las muestras, incluyendo el blanco.

Ahora, calcule la inversa de los valores medidos de relajación T uno o T dos y realice la gráfica. Represente estos valores frente a la concentración de Lathan en unidades de milimolar. Ajuste la gráfica con una línea recta. La pendiente de la línea ajustada es la actividad de relajación, siendo R uno o R dos para T uno y T dos, respectivamente.

Aquí observamos el esquema general para la mediación y la purificación. Este esquema describe el procedimiento general para la metilación y las razones para elegir diferentes rutas de purificación. Aquí vemos una gráfica representativa de decaimiento de luminiscencia en la que se representa el logaritmo natural del decaimiento frente al tiempo; las pendientes de las líneas obtenidas a partir de curvas similares, necesarias para soluciones acuosas y de óxido de deuterio, se utilizan junto con la ecuación uno para determinar el número de coordinación de agua de complejos que contienen ópalo.

Un ejemplo representativo de mediciones de lividad se puede ver aquí, con la pendiente de la línea ajustada siendo la lividad T uno de la muestra. Además del número de coordinación del agua y la caracterización de la lividad descritos en el protocolo, también es importante caracterizar los productos finales utilizando técnicas químicas estándar. La identidad del compuesto puede obtenerse mediante espectrometría de masas; aquí se muestran espectros de masas representativos que muestran los patrones isotópicos diagnósticos para complejos que contienen gadolinio y opio.

Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como espectroscopía ENDOR, HPLC y análisis elemental para caracterizar más a fondo los complejos resultantes. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar, purificar y caracterizar complejos que contienen lantánidos y que pueden utilizarse para marcar macromoléculas biológicas.