La piel humana tridimensional Reconstrucción del modelo: una herramienta para estudiar la piel normal y la progresión del melanoma
3 de agosto de 2011
En este informe se describe la piel en tres dimensiones reconstruir el modelo que imita la piel humana en la arquitectura y la composición. Fisiología de los melanocitos, la progresión del melanoma y el destino de las células madre dérmicas han sido investigados con la piel reconstruir el modelo. El modelo es también útil como una herramienta para la evaluación preclínica de medicamentos.
El objetivo general de este procedimiento es generar un tejido cutáneo humano tridimensional para estudios sobre la biología de los melanocitos, el melanoma y las células madre de la piel. Esto se logra primero recubriendo una inserción de bandejas de cultivo de tejidos con colágeno bovino neutralizado. El segundo paso consiste en formar el compartimento dérmico celular a partir de fibroblastos y colágeno.
A continuación, prepare el compartimento epidérmico a partir de queratinocitos mezclados con melanocitos o células de melanoma. El paso final del procedimiento consiste en obtener un reconstituto de piel al día 18 y trasplantar dicho reconstituto sobre un ratón. En última instancia, los análisis inmunohistoquímicos e inmunofluorescentes del injerto muestran la arquitectura de una piel normal que contiene melanocitos, así como la migración y diferenciación de células madre normales y fenotipos específicos del melanoma según la etapa.
Desarrollamos el modelo de reconstrucción de la piel hace 20 años porque, desde el principio de nuestros estudios, descubrimos que los melanocitos normales o las células de melanoma cultivadas en un plato se comportan de manera muy distinta a las células que se encuentran en un contexto tisular. Por lo tanto, el modelo de reconstrucción de la piel es ideal para observar cómo las células se desplazan de un compartimento en la piel a cualquier otro lugar. La mezcla de colágeno acelular previamente preparada se mantiene en hielo y luego se añade un mililitro de la solución de color amarillo paja en cada inserto de una placa de seis.
Incube la bandeja de cultivo de tejidos en pocillos durante 30 minutos a temperatura ambiente para permitir que el gel se solidifique. Durante este tiempo, la solución debe cambiar de color de amarillo a rosa mientras el gel se solidifica. Pase las células fibroblastos humanas desde su frasco de cultivo con tripsina-EDTA al 0,25% tras cinco minutos. Añada DMEM que contenga 10% de SFB para neutralizar el proceso de disociación.
Recolecte las células desprendidas mediante centrifugación durante cinco minutos a 200 G a temperatura ambiente, y luego resuspenda las células a 4,5 veces 10 a la quinta células por 1,5 mililitros. DMEM suplementado con 10 % FBS. A continuación, llene un tubo de 50 mililitros con la mezcla de colágeno y capa celular previamente preparada y coloque el tubo en hielo.
Agregue 1,5 mililitros de la suspensión de fibroblastos al tubo y mezcle bien. Añada tres mililitros de la solución de capa celular amarillo paja a cada inserto recubierto con capa acelular. A continuación, incube la bandeja de cultivo de tejidos durante 45 minutos a 37 grados Celsius en un incubador de cultivo de tejidos con 5% de dióxido de carbono durante el período de incubación.
El color de la solución de la capa celular también debe cambiar de amarillo a rosa. Una vez que la capa superior del gel se solidifique, agregue dos mililitros de DMEM que contenga 10% FBS al interior del inserto en la bandeja de cultivo de tejidos, y 10 mililitros al exterior del inserto. Incube las bandejas de cultivo de tejidos durante cuatro días.
El cuarto día, compruebe que el gel se ha contraído; aspire el medio tanto del interior como del exterior de cada inserto. Añada dos mililitros de medio de lavado al interior y 10 mililitros al exterior de los insertos para eliminar el suero habitual. A continuación, incube las placas durante una hora a 37 grados Celsius para la generación de la epidermis.
Primero, la tripsina se aplica a los queratinocitos humanos. Luego, después de cinco minutos, utilice el inhibidor de tripsina de soja para neutralizar la tripsina tras centrifugar las células desprendidas a 200 G durante cinco minutos. Vuelva a suspender el sedimento celular a 4,17 × 10⁶ células por mililitro en piel.
Reconstruya el medio una vez que se hayan recolectado los queratinocitos. Incube los melanocitos humanos con tripsina en hielo durante uno o dos minutos. Nuevamente, neutralice la tripsina con inhibidor de tripsina de soja.
Luego, tras centrifugar las células en las mismas condiciones que antes, re-suspenda el sedimento de melanocitos a 8,3 × 10⁵ células por mililitro en medio de reconstrucción cutánea. También re-suspenda el medio uno. A continuación, retire el medio de lavado tanto del interior como del exterior de cada inserto de una bandeja de cultivo tisular con capa dérmica preparada.
Sustituya el medio de lavado añadiendo 1,5 mililitros de medio de reconstrucción dérmica, uno al interior y 10 mililitros al exterior de cada inserto. Luego mezcle 600 microlitros de la suspensión de queratinocitos con 600 microlitros de la suspensión de melanocitos. Dispense 200 microlitros de la suspensión mixta de células.
Gota a gota en el interior de cada inserto. Incubar la bandeja de cultivo de tejidos durante dos días a 37 grados Celsius. Tras la incubación, aspirar el medio de reconstrucción de la piel, medio uno, tanto del interior como del exterior de cada inserto, y luego añadir dos mililitros del medio de reconstrucción de la piel, medio dos, al interior y 10 mililitros al exterior del inserto.
Luego, incubar los reconstrucciones durante otros dos días a 37 grados celsius. Después de la segunda incubación de dos días, aspirar el medio de reconstrucción de la piel dos desde el interior y el exterior de cada inserto. Ahora, añadir 7,5 mililitros del medio de reconstrucción de la piel tres únicamente al exterior de los insertos.
Coloque los reconstruidos nuevamente en el incubador y cambie el medio. Renueve el medio de los reconstruidos cada dos días hasta el día 18. En el día 18 de la incubación, aspire el medio del interior y del exterior de los insertos de una bandeja de cultivo de tejidos con reconstrucciones dérmicas.
Retire los insertos de la bandeja con pinzas. Recorte el constructo incluyendo el filtro de policarbonato trazando un círculo cercano al borde con una hoja de bisturí. Luego, coloque el reconstructo en el filtro sobre una superficie dura y córtelo por la mitad con la hoja.
Coloque una mitad del reconstruido sobre un papel de biopsia TBS negro y luego coloque el papel en una caja de histología. Sumerja toda la caja en formalina al 10% durante más de cuatro horas. A continuación, coloque la caja en etanol al 70% y almacénela a cuatro grados Celsius hasta que esté listo para procesar el reconstruido para inclusión en parafina.
Coloque la otra mitad del reconstruido en sacarosa al 50 % a cuatro grados Celsius durante una a dos horas. Luego cambie la sacarosa a dos molar y almacénela a cuatro grados Celsius durante otras una a dos horas. Llene un molde base hasta la mitad con temperatura de corte óptima, medio de congelación u OCT.
Evite cualquier burbuja. Sujete el borde del reconstruido con pinzas y retire el reconstruido del azúcar. Colóquelo sobre toallitas Kim hasta que se absorba el azúcar.
Utilizando pinzas y una espátula, transfiera el reconstruido al barco encima del OCT. Cubra la parte superior del reconstruido con más OCT hasta que el barco esté completamente lleno. Nuevamente, evitando burbujas.
Coloque el barco uniformemente sobre hielo seco triturado para permitir que el OCT se congele completamente. Luego envuelva el molde base y el papel de aluminio y guárdelo a menos 70 grados Celsius hasta que esté listo para cortarlo con un criostato. Para prepararse para el injerto de un reconstruido cutáneo en un ratón, llene un recipiente con nitrógeno líquido y agregue cinco mililitros de DMEM a un tubo de 50 mililitros.
Llene un vaso de precipitados con 600 mililitros de agua del grifo y coloque el vaso sobre una placa calefactora para calentar. Luego seleccione un ratón hembra sin pelo, fuera de cría, de aproximadamente seis semanas de edad. Después anestesie el ratón con isoflurano.
Utilice un cono nasal para mantener la anestesia durante todo el procedimiento. Aplique lubricante oftálmico estéril y brinde soporte térmico para prevenir la hipotermia. A continuación, limpie la piel del ratón con tintura de bencina compuesta y toallitas preparadas con alcohol.
Marque una línea en la parte superior de la espalda del ratón para mantener la misma posición durante la sutura posterior. Corte un lecho de herida circular en la espalda del ratón utilizando tijeras de iris y pinzas, y luego cubra el lecho de herida con esponjas de gasa estéril. Coloque la piel redonda del ratón en el tubo de 50 mililitros de DMEM.
Sumerja el tubo en un recipiente con nitrógeno líquido hasta que todos los medios y el tejido estén completamente congelados. A continuación, descongele el tubo en un vaso de agua caliente hasta que se descongele por completo. Repita este procedimiento de congelación y descongelación tres veces.
Utilice una hoja quirúrgica para separar un reconstruido de piel de un inserto. Retire la membrana con mucha precaución y luego transfiera el reconstruido de piel a la superficie del lecho de la herida en el ratón. A continuación, coloque la piel del ratón encima del reconstruido de piel.
Asegúrese de que la primera sutura esté encima del marcador previamente etiquetado y de que la segunda esté en la parte inferior. Luego use otras dos suturas en los lados de la reconstrucción de la piel para fijar la piel del ratón. Limpie la piel del ratón después del injerto y luego coloque al ratón en una jaula nueva.
En el día 18, la epidermis de los reconstrucciones cutáneas está compuesta por capas estratificadas de queratinocitos; la capa basal indiferenciada y las capas diferenciadas secuenciales están orientadas verticalmente. Tinción de la sección de las reconstrucciones con el marcador melanocítico.
S 100, tal como indican las flechas negras, muestra que los melanocitos están alineados en la capa basal de la epidermis y se comunican con múltiples queratinocitos mediante extensiones dendríticas. El compartimento dérmico contiene fibroblastos incrustados en una matriz de colágeno tipo uno; el colágeno tipo cuatro indica la membrana basal, que separa la epidermis de la dermis. Las siguientes figuras ilustran cómo se desarrollan múltiples capas de queratinocitos en la epidermis.
Cuando las células madre dérmicas marcadas con un vector lentiviral GFP se incorporan junto con fibroblastos en una matriz de colágeno tipo uno, migran hacia la epidermis y se diferencian en melanocitos al quinto día. Después de sembrar queratinocitos, células individuales comienzan a migrar desde las esferas.
Téngase en cuenta que la epidermis aún está compuesta por una sola capa. Al octavo día, algunas células alcanzan la interfaz entre la epidermis y la dermis.
Al día 10, las células positivas para GFP están estrechamente alineadas en la posición de la membrana basal, como se puede observar aquí. Las células positivas para GFP migradas en la epidermis expresan el marcador melanocítico HMB 45. Cuando se incorporan líneas celulares de melanoma en diferentes estadios en reconstrucciones cutáneas, el comportamiento de las células refleja sus características in vivo.
Aquí se pueden observar melanocitos normales y células de melanoma cultivadas en cultivos 2D en esta figura. La ubicación y la tasa de crecimiento de los melanocitos normales están estrictamente controladas en los reconstrucciones de piel, como se observa aquí; los melanomas primarios en fase de crecimiento radial proliferan predominantemente en la epidermis, mientras que los melanomas en fase de crecimiento vertical crecen de forma invasiva hacia la dermis, como se ve en esta figura. Finalmente, aquí se puede observar la forma en que los melanomas metastásicos invaden agresivamente en profundidad hacia la dermis.
Nuestros estudios en piel normal proporcionan la base para un mejor conocimiento del desarrollo y la progresión del melanoma.
Resumen
Este informe describe un modelo de reconstrucción cutánea tridimensional que imita la arquitectura y la composición de la piel humana. El modelo se ha utilizado para estudiar la fisiología de los melanocitos, la progresión del melanoma y el destino de las células madre dérmicas, sirviendo como una herramienta preclínica valiosa para la evaluación de fármacos.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Oncología
Antecedentes
- El modelo de reconstrucción de la piel se desarrolló para comprender mejor el comportamiento celular en un contexto tisular.
- Los melanocitos normales y las células de melanoma presentan comportamientos diferentes en cultivo en comparación con los observados in vivo.
- Este modelo permite la observación de la migración y diferenciación celular dentro de los compartimentos de la piel.
- Ha estado en desarrollo durante más de 20 años, aportando conocimientos sobre la biología de la piel.
Objetivo del estudio
- Generar un modelo tridimensional de piel humana para estudiar la biología de los melanocitos y del melanoma.
- Investigar las interacciones entre diferentes tipos de células de la piel.
- Evaluar la utilidad del modelo en pruebas preclínicas de fármacos.
Métodos Utilizados
- Recubrimiento de bandejas de cultivo de tejidos con colágeno bovino neutralizado.
- Creación de un compartimento dérmico celular mediante fibroblastos y colágeno.
- Formación de un compartimento epidérmico a partir de queratinocitos mezclados con melanocitos o células de melanoma.
- Realización de análisis inmunohistoquímicos e inmunofluorescentes en reconstrucciones cutáneas injertadas.
Resultados principales
- El tejido cutáneo reconstruido imitó con éxito la arquitectura de la piel humana normal.
- Los melanocitos y las células madre demostraron migración y diferenciación dentro del modelo.
- Se observaron fenotipos de melanoma específicos de cada etapa en la piel reconstruida.
- El modelo resultó eficaz para la evaluación preclínica de fármacos.
Conclusiones
- El modelo de reconstrucción cutánea tridimensional es una herramienta valiosa para estudiar la biología de la piel.
- Proporciona información sobre el comportamiento de los melanocitos y la progresión del melanoma.
- El modelo puede facilitar el desarrollo y la evaluación de nuevas estrategias terapéuticas.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El modelo tridimensional de reconstrucción de piel humana permite investigar de forma predictiva y relevante para el ser humano la biología de los melanocitos y la progresión del melanoma, superando las limitaciones traductivas de los cultivos en 2D y los sistemas murinos. Este modelo facilita la desactivación mecanicista de riesgos y la validación de dianas para programas oncológicos y dermatológicos en fases iniciales. Su capacidad para reproducir interacciones nativas entre célula-célula y célula-matriz proporciona una plataforma robusta para la selección de carteras y la toma de decisiones en fases preclínicas.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Permite investigar la homeostasis de los melanocitos y el inicio del melanoma en un contexto fisiológicamente relevante.
- Apoya la validación funcional de dianas mediante la modelización de la migración celular, la diferenciación y la progresión tumoral.
- Facilita la reducción mecanicista de riesgos al distinguir fenotipos de melanoma específicos de cada etapa en una arquitectura tisular similar a la humana.
Desarrollo de Pruebas y Cribado
- Proporciona un sistema 3D validado para la evaluación cuantitativa del comportamiento celular y los efectos de compuestos.
- Permite la medición reproducible de la localización celular, proliferación e invasión en diferentes condiciones experimentales.
- Facilita la estandarización de ensayos para el cribado posterior de terapéuticos candidatos que actúan sobre la biología de la piel o del melanoma.
Investigación Translacional y Preclínica
- Se alinea con la arquitectura de la piel humana relevante para la enfermedad, mejorando la confianza traslacional frente a los modelos murinos.
- Permite la evaluación de la migración y diferenciación de células madre, apoyando el descubrimiento y la validación de biomarcadores.
- Posibilita el avance ajustado al riesgo de candidatos mediante la modelización del potencial metastásico y las interacciones con el microambiente tumoral.
Integración de la Línea de Proceso y Flujo de Trabajo
Este modelo de reconstrucción cutánea tridimensional conecta el descubrimiento inicial, la validación de dianas y la investigación preclínica para programas de piel y melanoma.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la prueba de hipótesis sobre interacciones célula-célula y célula-matriz en el contexto de la piel humana.
- Selección: Proporciona resultados cuantitativos y reproducibles para la evaluación de compuestos y la selección fenotípica.
- Análisis: Permite lecturas inmunohistoquímicas e inmunofluorescentes para el análisis comparativo de estados celulares y progresión tumoral.
- Investigación Traducional: Ofrece continuidad desde el descubrimiento in vitro hasta la validación similar a in vivo, mejorando el valor predictivo para la traducción clínica.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una plataforma reutilizable adaptable a diversos tipos celulares y modelos de enfermedad dentro de carteras de dermatología y oncología.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva y reduce la ambigüedad mecanicista en la investigación de la piel y el melanoma.
- Valor operativo: Estandariza la modelización de tejidos complejos, mejorando la reproducibilidad y escalabilidad entre los equipos de I+D.
- Valor estratégico: Orienta las decisiones de avance o interrupción de proyectos y la asignación de capital al proporcionar datos relevantes para humanos en las primeras etapas del proceso.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización y el avance ajustados al riesgo de candidatos terapéuticos dirigidos a la biología de la piel y el melanoma.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en cultivo primario de células, ingeniería de tejidos y análisis histológico.
- Exige acceso a infraestructura especializada de cultivo celular y plataformas de imagen para análisis finales.
- Necesita la estandarización entre equipos de los protocolos para garantizar la reproducibilidad y la comparabilidad de los datos.
- Adaptable a diversos tipos celulares y modelos de enfermedades, aunque puede requerirse optimización para preguntas de investigación específicas.
- Las limitaciones incluyen la necesidad de habilidad técnica en cultivos tridimensionales y la posible variabilidad en las fuentes de células primarias.
