Electrodos múltiples grabaciones matriz de avalanchas neuronal en cultivos organotípicos

El objetivo de este experimento es estudiar la autoorganización de la actividad cerebral sana en avalanchas neuronales, característica distintiva de la dinámica en estado crítico en la corteza. Esto se logra combinando una porción coronal de corteza laminada junto con una porción de mesencéfalo, que proporciona entradas dopaminérgicas importantes desde el punto de vista del desarrollo a la corteza. Como segundo paso, el cultivo conjunto de corteza y mesencéfalo se desarrolla sobre una matriz de múltiples electrodos, lo que permite la estimulación y grabación de actividades neuronales en múltiples sitios dentro del cultivo.

A continuación, permitimos que el cultivo conjunto se aplane, se expanda y se adhiera a la superficie de la MEA durante las primeras una a dos semanas en un incubador de diseño personalizado, que expone al cultivo cíclicamente al aire normal y al medio de cultivo. Se obtienen resultados en fluido que muestran la autoorganización espontánea de ráfagas de potenciales de campo locales espacio-temporales en avalanchas neuronales. Basado en grabaciones de MEA y análisis offline de avalanchas que identifican la ley de potencia en los tamaños de las avalanchas.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes, como los cultivos disociados, es su enfoque sistémico en neurociencia. Podemos realizar cultivos conjuntos de muchas regiones cerebrales y estos cultivos de múltiples regiones establecen una organización cerebral que es correcta a gran escala, como las capas corticales y los sistemas de proyección. Las aplicaciones de esta técnica van más allá del estudio de las avalanchas neuronales.

Por ejemplo, podemos estudiar el estímulo en respuesta a nivel de red bajo condiciones in vitro rigurosamente controladas. La demostración visual de este método es fundamental, ya que la aplicación adecuada de la mezcla de trombina plasmática y la colocación del tejido sobre la MEA son difíciles de aprender. Estos pasos requieren una temporización precisa, el gradiente de temperatura adecuado y evitar tocar directamente la delicada superficie de la MEA.

Para preparar una cámara de vidrio sellable estéril para grabaciones, primero corte cilindros de vidrio roscados con una tapa de plástico de teflón, aproximadamente dos milímetros desde la parte inferior de la rosca. Estos son necesarios para lograr un cierre seguro y hermético de la cámara de cultivo. Luego, limpie los anillos de vidrio enjuagándolos con agua tres veces y hirviéndolos durante cinco minutos en alcohol etílico al 200 grados de pureza.

Deje estos elementos a un lado para que sequen, ya que se requiere una solución de silicona para fijar los anillos de vidrio a la superficie del MEA. Utilice un kit de elastómero de silicona Cell Guard 180 4 y mezcle completamente 15 mililitros de las partes A y B. Luego, déjelo reposar durante 15 minutos para eliminar las burbujas de aire.

Divida la solución en un mililitro de Eloqua y almacénelo a menos 20 grados Celsius para uso futuro. Ahora pegue un anillo de vidrio al MEA tomando un mililitro de silicona a 23 grados Celsius en una jeringa con una aguja de calibre pequeño y aplicándolo sobre la superficie cortada sin pulir del anillo de vidrio. Luego centre el anillo de vidrio sobre el MEA y aplique una capa adicional de silicona alrededor del exterior del anillo para obtener un sello más resistente.

Deje que cure de una a dos horas a aproximadamente 60 grados Celsius sobre una placa calefactora. A continuación, esterilice la cámara MEA y las tapas de la cámara bajo una campana de flujo laminar enjuagando tres veces con agua desionizada y luego tres veces con alcohol al 70% para el último enjuague. Deje la cámara reposar durante 10 minutos en el alcohol.

A continuación, exponga el interior de la cámara y de la tapa a luz UV durante 10 minutos. Autoclave a 120 grados Celsius durante 45 minutos. Una vez esterilizados, deje que sequen.

Ahora recubra la superficie de la MEA dentro de la cámara de cultivo con poli-D-lisina. Las nuevas MEAs utilizadas en este experimento son bastante lipofílicas, por lo tanto, realice el recubrimiento mediante gotas repetidas. Aspire la solución de la rejilla de electrodos.

Coloque la tapa para sellar la cámara de la MEA y almacenarla para su uso futuro. Este procedimiento proporciona secciones de corteza y VTA para aproximadamente 12 cultivos conjuntos y debe realizarse dentro de una cabina de flujo laminar bajo condiciones estériles, utilizando animales sanos de uno a dos días posnatales; el tiempo total para la recolección de tejido debe ser inferior a una hora. Tras la decapitación, comience la extracción del cerebro realizando primero dos cortes laterales con tijeras para retirar la piel del cuero cabelludo.

Retire y luego corte el cráneo con tijeras finas para ojos, realizando un corte sagital en la línea media y un corte coronal en la unión entre la corteza y el cerebelo. Doble hacia atrás las cuatro solapas óseas para exponer el cerebro. A continuación, con una espátula afilada, corte frontalmente a través del bulbo olfatorio.

Luego, avance la espátula cada trimestre debajo del cerebro. Levante suavemente el cerebro del cráneo y deje que se deslice hacia la solución de enfriamiento. Solución para enfriamiento rápido y almacenamiento temporal.

Repita el procedimiento anterior para otros dos cerebros. Para obtener el tejido de la VTA, transfiera los cerebros a una placa de Petri estéril y seca. Utilizando una espátula pequeña, elimine cualquier exceso de líquido deslizando suavemente cada cerebro lateralmente aproximadamente un centímetro.

Luego, use una cuchilla de afeitar para extraer el bulbo raquídeo realizando un corte vertical coronal a nivel del cerebelo. Ahora, pegue un bloque de agar sobre un disco de montaje para la estabilización mecánica de los cerebros durante el procedimiento de corte. A continuación, coloque una fina línea de pegamento rápido, unos pocos milímetros por delante del bloque de agar sobre el disco, pero evite que el pegamento toque el agar utilizando una espátula pequeña.

Transfiera y monte cada cerebro con el polo frontal hacia abajo. Asegúrese de que los polos frontales estén pegados al disco de montaje y de que los lados ventrales toquen el agar sin residuos de pegamento. Esto garantiza una estabilización mecánica adecuada durante el corte y una fácil separación de las secciones cortadas.

A continuación, sumerja y asegure cuidadosamente el disco de montaje con los cerebros montados en una bandeja de vibram llenada con solución de gaze fría. Luego, con una cuchilla de afeitar cuidadosamente limpia, corte secciones coronales de 400 micrómetros de grosor del mesencéfalo a la frecuencia de vibración más alta y una velocidad de avance relativamente baja; utilice una pipeta de pasta invertida con perilla de succión para recoger y transferir las láminas que contienen la VTA a placas de Petri de 35 por 10 milímetros llenadas con solución de gaze fría estéril para secciones corticales. Repita los pasos previos de corte, pero realice un corte vertical entre la corteza y el cerebelo, y monte los cuatro cerebros con el polo frontal hacia arriba.

Recolecte aproximadamente tres cortes coronales de 350 micrómetros de grosor, comenzando a nivel del estriado. Ahora, utilizando un microcuchillo hecho de hojas de afeitar rotas, seccione bajo un microscopio estereoscópico secciones coronales de aproximadamente dos milímetros de ancho de las áreas de la corteza frontal y del mesencéfalo que contienen la VTA. Recolecte la sección de tejido por separado en pequeños recipientes llenos con solución salina fría.

Para comenzar el montaje del tejido en la cámara de MEA en la posición inicial, coloque la MEA a temperatura ambiente bajo un microscopio estereoscópico con la matriz de electrodos enfocada. Luego, centre una gota de 25 microlitros de plasma sobre la matriz de electrodos limpia, libre de polvo y estéril. Utilizando una espátula pequeña, deslice cuidadosamente una sección de corteza y VTA dentro de la gota de plasma.

Ahora coloque la MEA sobre una placa de enfriamiento y enfoque nuevamente la vista. Deje enfriar durante aproximadamente 15 segundos antes de añadir 25 microlitros de trombina en la gota de plasma. Luego, utilizando la punta de pipeta de trombina, extienda cuidadosamente la mezcla de plasma y trombina con pequeños movimientos circulares sobre la MEA.

Tenga cuidado de no tocar directamente el arreglo de electrodos frágil. A continuación, coloque suavemente la corteza sobre el arreglo con el borde dorsal a lo largo de la segunda fila de electrodos del arreglo. De este modo, las capas superficiales en desarrollo eventualmente cubrirán el resto del arreglo.

Luego, coloque la VTA adyacente al borde ventral de la sección cortical. Ahora coloque la tapa y cierre ligeramente la cámara de MEA para mantener una humedad alta. Deje que el ensamblaje de cultivo de MEA repose durante aproximadamente seis minutos dentro de la campana a temperatura ambiente para permitir la coagulación, el elution del plasma trombina.

Mientras tanto, repita el procedimiento para preparar tres cultivos más. A continuación, agregue cuidadosamente en pequeñas gotas 600 microlitros de medio de cultivo a las cámaras de cultivo, utilizando una jeringa de un cc con una aguja de calibre 25 por cinco octavos. Luego cierre firmemente la cámara MEA y coloque el conjunto de cultivo MEA sobre la bandeja de almacenamiento oscilante dentro del incubador.

Después de dos días in vitro, agregue 10 microlitros de inhibidor de mitosis. Luego renueve el medio de cultivo en un 60 % a los cuatro días in vitro y cada cuatro días posteriores. Durante el crecimiento normal, el cultivo se aplanará considerablemente y se expandirá ligeramente en dirección dorsal.

Debido al desarrollo de las capas corticales superficiales, una cultura saludable se identifica por su tejido opaco de color grisáceo en campo claro. Por el contrario, las vesículas brillantes y reflectantes, característica de células muertas en degeneración, indican que las culturas están listas para la grabación y estimulación aproximadamente entre 10 y 12 días después de su preparación. Para iniciar una sesión de grabación, la MEA se transfiere desde la bandeja de almacenamiento hasta la plataforma del cabezal de grabación.

Para registrar el potencial de campo local o LFP, utilice un filtro de paso de banda de uno a 200 hercios. La actividad multiunidad también puede estudiarse utilizando un filtro de paso de banda de 300 a 3000 hercios. La actividad espontánea saludable tiende a ocurrir en ráfagas de tamaño y duración diversos.

Para estudiar la relación entre la actividad de potenciales de campo locales (LFP) y la actividad de unidades, podemos calcular los promedios desencadenados por picos del LFP. En estas culturas corticales, las deflexiones negativas del LFP se correlacionan con la generación de potenciales de acción neuronales para registrar la actividad evocada por el estímulo. Primero, se especifican mediante software la forma de onda temporal y la amplitud de los estímulos, que controla un generador de estímulos.

Un paradigma de estimulación útil es el choque único controlado por corriente y neutro en carga con forma de onda cuadrada bipolar. A continuación, se selecciona un electrodo que se utilizará para administrar los estímulos. Las respuestas típicas de PCL evocadas por el estímulo son similares a las ráfagas de actividad espontánea.

La circuitería de enmascaramiento desconecta los amplificadores durante la estimulación para reducir los artefactos de estímulo y prevenir la saturación del amplificador. El electrodo de estimulación requiere varios segundos para recuperarse después de la estimulación y, por lo tanto, no puede utilizarse para registrar la actividad de respuesta. En la matriz de electrodos, la actividad tiende a surgir en agrupamientos espacio-temporales, con actividad en un electrodo, frecuentemente acompañada por actividad en otros sitios.

Al mismo tiempo, aquí se muestran las formas de onda típicas del potencial de campo local (LFP) durante estos períodos de actividad mediante la superposición de tres grupos que ocurren varios segundos aparte para cada grupo. Se pueden observar desviaciones negativas del LFP en varios electrodos dentro de una ventana de un segundo al extraer los picos del NLFP que superan un umbral de múltiples desviaciones estándar negativas; la actividad en forma de tiempos pico del NLFP se visualiza convenientemente en un Rasta en el que columnas de puntos representan NPS casi coincidentes en varios electrodos. La organización espacio-temporal de esta actividad es bastante compleja.

Las columnas que aparecen más o menos homogéneas a baja resolución temporal están compuestas por grupos separados a mayor resolución temporal, y así sucesivamente. La aparición de grupos espaciales, GEOTEMPORAL y de potenciales de campo locales (LFP) está altamente organizada en redes corticales. Más específicamente, la organización es invariante a escala para las avalanchas neuronales.

Esto se demuestra calculando la probabilidad de tamaños de agrupaciones para una resolución temporal dada, Delta T. Aquí, las agrupaciones están compuestas por PSLN que ocurren en los mismos intervalos de tiempo o en intervalos sucesivos; cuando el tamaño de dicha agrupación se expresa como el número total de PSLN por agrupación o como las amplitudes integradas de PSLN por agrupación, las distribuciones del tamaño de las agrupaciones revelan una ley de potencia con un exponente cercano a menos 1,5. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseccionar cuidadosamente el tejido cerebral y cultivar preparaciones sobre matrices de electrodos múltiples para estudiar la autoorganización de la actividad neuronal.

Estos métodos también se han utilizado para estudiar la relación entre la actividad espontánea y la actividad evocada por estímulos en redes corticales.