Entrega génica eficaz en los territorios del SNC múltiples utilizando In Utero La electroporación

El objetivo general de este procedimiento es alterar la expresión génica en las neuronas del sistema nervioso central embrionario. Esto se logra primero obteniendo hembras preñadas sincronizadas y preparándolas para la cirugía. A continuación, se exponen los cuernos uterinos mediante una incisión abdominal.

Una vez expuestos los embriones, se inyecta ADN en el ventrículo lateral, el tercer ventrículo o el espacio subretiniano. El paso final del procedimiento consiste en aplicar una corriente eléctrica al embrión a través de la pared uterina, orientando los electrodos de paleta de manera que el polo positivo se coloque sobre el sitio preferido de transfección. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran la proliferación, migración y diferenciación de los progenitores neuronales en el cerebro en desarrollo y la retina mediante microscopía de inmunofluorescencia.

La principal ventaja de esta técnica frente a métodos existentes, como la degeneración de ratones transgénicos, es que es rápida, permite estudios de mayor rendimiento y tiene un costo más bajo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo neural, como qué genes regulan al progenitor neural, la proliferación celular, la especificación del destino celular, la diferenciación neuronal y la migración celular. Las implicaciones de esta técnica podrían extenderse hacia una mejor comprensión de las vías genéticas que subyacen a los defectos en el desarrollo del sistema nervioso central, muchos de los cuales resultan en discapacidad cognitiva y trastornos del comportamiento en humanos. Más allá de su utilidad para comprender el desarrollo del sistema nervioso central.

Esta técnica también puede aplicarse a otros sistemas orgánicos, como el sistema nervioso periférico en desarrollo, el corazón y la placenta. Asimismo, puede utilizarse para estudiar modelos de enfermedades en ratones y otros organismos modelo como el pollo y el xip. En general, el principal obstáculo para el éxito en personas nuevas en esta técnica es el cuidado de la supervivencia del embrión, por lo que se debe tener precaución al manipular, inyectar y verter los embriones.

Tuvimos por primera vez la idea de este método cuando necesitábamos un medio rápido para manipular la expresión génica en el telencéfalo y la retina embrionarios. Desarrollamos esta técnica en nuestro laboratorio modificando el método descrito inicialmente por Sal, publicado en la revista Developmental Biology en 2001. También colaboramos con un laboratorio externo para establecer este protocolo en el dilon en desarrollo.

La demostración visual de este método es fundamental, ya que los pasos de inyección y electroforesis son difíciles de aprender porque requieren una manipulación muy cuidadosa de los embriones y, en ocasiones, los sitios de inyección pueden ser muy pequeños. Por ejemplo, el espacio subretiniano. Quien demostrará el procedimiento hoy será Rajiv, un posdoctorado del Laboratorio de Sherman. Para comenzar, limpie y esterilice todas las herramientas quirúrgicas. A continuación, llene las jeringas con solución salina y solución de Ringer con lactato y colóquelas sobre una almohadilla calefactora para calentarlas en el área quirúrgica.

Sterilice una almohadilla calefactora con etanol al 70 % y luego cúbrala con una gasa esterilizada sin pelusas. Configure la almohadilla calefactora a 37 grados Celsius. Coloque el animal en una pequeña cámara de anestesia y anestésielo administrando isoflurano al 5 % con oxígeno a un litro por minuto a través de un vaporizador.

Asegurándose de recoger el escape de isóforo fluorado utilizando un sistema de captación. Una vez que la respiración del animal sea profunda y regular, retírelo de la cámara. Utilice el pellizco en el dedo del pie y los reflejos del parpadeo ocular.

Para asegurar una anestesia completa, coloque el animal anestesiado sobre su vientre y utilice un tubo de respirador para administrar 2,25 %v/v de fluoruro durante la cirugía. Inyecte buprenorfina a una concentración de 0,1 miligramos por kilogramo de peso corporal por vía subcutánea en la nuca.

Continúe monitoreando la respiración del animal y ajuste el flujo de isoflurano si es necesario. Luego, sujete con cinta a través del tórax del animal anestesiado y verifique nuevamente la respuesta de retracción pellizcando el pie trasero con pinzas romas. Utilizando un aplicador estéril con punta de algodón, extienda una capa espesa de crema de- sobre el abdomen, asegurándose de que el pelaje inferior quede completamente recubierto.

Deje la crema durante aproximadamente tres minutos y verifique periódicamente la eliminación del vello. Con un hisopo estéril, humedezca una gasa estéril con agua estéril y limpie el vello del abdomen. A continuación, esterilice el sitio de incisión con clorhexidina y más agua.

Seque el abdomen con gasa estéril limpia. Repita este paso con etanol al 70 % utilizando gasa de algodón esterilizada nueva. Prepárese para la cirugía poniéndose la vestimenta quirúrgica para exponer los cuernos uterinos.

Primero, localice la línea alba como la línea tenue debajo de la piel en la línea media. Con pinzas, tire de la piel alejándola de la pared abdominal y realice una pequeña incisión recta desde el abdomen medio hacia abajo con tijeras para piel, utilizando pinzas curvas y tijeras. Repita el proceso con el peritoneo. Sujete el peritoneo con las pinzas.

Separar y luego realizar una incisión lo suficientemente grande como para extraer el útero a través de ella. Colocar una gasa estéril con una pequeña hendidura vertical sobre la incisión y humedecerla con solución salina estéril tibia. A continuación, introducir la pinza en la incisión y localizar el útero, manteniendo la incisión abierta con la pinza.

Sujete el útero entre el primer y segundo embrión visibles y tire suavemente de ambos cuernos uterinos hacia la gasa. Cuente el número de embriones, anotando cualquier reabsorción o embriones con tamaño corporal reducido. Para preparar el número correcto de inyecciones de ADN, humedezca los cuernos uterinos con solución salina y devuelva cuidadosamente un cuerno uterino al abdomen.

Para cargar las agujas quirúrgicas, utilice una pipeta Pasteur con punta estrechada y unido a un aplicador bucal para aspirar 10 microlitros de una solución de tres miligramos por mililitro. Solución de ADN libre de endotoxinas que contiene colorante verde metilo y expulse el ADN en una aguja quirúrgica. Monte la primera aguja cargada en el micromanipulador.

Colóquese en el soporte conectado al inyector comenzando con el embrión más cercano al ovario. Utilice fórceps circulares para girar suavemente el embrión dentro de la decidua de manera que quede orientado con la cara hacia adelante, permitiendo que las inyecciones se realicen en dirección desde la región ROS hacia el cordón. Utilice una fuente de luz de fibra óptica para identificar la línea media del cerebro embrionario.

Observe los grandes ventrículos laterales flanqueados en las regiones rostrales. Sujete al embrión en su lugar utilizando fórceps curvos y coloque la aguja quirúrgica cargada por encima del útero, de manera que el ángulo de entrada al cerebro sea aproximadamente de 45 grados. Con un movimiento rápido y constante, gire el dial del micromanipulador para insertar la punta de la aguja a través de la pared uterina y dentro del ventrículo lateral del cerebro embrionario.

A continuación, presione la perilla del microinyector. Para inyectar la solución de ADN, una inyección exitosa se visualiza fácilmente por la dispersión del colorante verde metilo a través de los ventrículos cerebrales del embrión. Ahora que se ha inyectado el ADN, retire lentamente la aguja hacia arriba para extraerla sin causar roturas.

Coloque el embrión inyectado sobre la gasa estéril y humedézcalo completamente con solución salina tibia. Sujete el útero con el polo positivo del electrodo de paleta colocado sobre el sitio deseado de transfección. Luego, aplique cinco pulsos eléctricos cuadrados de 40 a 50 voltios y 50 milisegundos a una frecuencia de un pulso por segundo.

Cubra el embrión inyectado y electroporado con gasa húmeda protectora, y luego continúe con la inyección del siguiente embrión. Una vez finalizada la inyección y electroporación de todos los embriones deseados en el cuerno uterino, empuje cuidadosamente este último de vuelta hacia la cavidad corporal. Retire el segundo cuerno uterino para comenzar la inyección y electroporación de los embriones restantes.

Una vez que todos los embriones estén nuevamente dentro del útero, agregue dos a tres mililitros de solución salina tibia a la cavidad abdominal y luego retire la gasa del abdomen para exponer los laterales del peritoneo. Utilice hilo de seda negra trenzada para suturar el peritoneo, anclando el hilo en la parte del peritoneo más cercana al esternón y continuando la sutura alejándose del punto de anclaje. Asegúrese de que todas las suturas estén bien ajustadas y de que ningún órgano subyacente ni la piel queden cosidos al peritoneo.

Corte la línea restante de sutura y deséchela. Cierre la piel sobre la línea de sutura con pinzas utilizando grapas para cierre de piel. Corte la piel teniendo cuidado de no colocar las grapas sobre la línea de sutura debajo ni de tensar demasiado la piel.

Una vez finalizado, asegúrese de que las grapas estén bien ajustadas presionando suavemente con la herramienta de sutura aquí, A-P-C-I-G. Se ha electro porado un vector de expresión que dirige la expresión de GFP en la neocorteza en desarrollo en el día E 12. A medida que avanza el desarrollo neocortical, los progenitores apicales se diferencian en progenitores basales secundarios o en neuronas posmitóticas, continuando además con la expresión de GFP. Estas células neuronales pueden analizarse entonces para detectar la expresión de marcadores típicos del subtipo neural mostrado en rojo.

En esta vista ventral del cerebro anterior de un embrión electro porado en el día E12 y diseccionado en el día E14, el sitio electro porado se indica mediante la fluorescencia epi verde observada en el día E14. La expresión de GFP se observa en el tálamo, pre-tálamo e hipotálamo, lo que indica que los territorios diencefálicos han sido transfectados con éxito. El cuadro punteado marca la ubicación de la sección a través de una zona ventricular.

Un examen más detallado de la zona ventricular muestra la migración de células GFP fuera de la zona ventricular y hacia la zona de la capa basal. Donde se formarán los núcleos hipotalámicos, la retina embrionaria también se puede electroporar fácilmente, como se observa en esta sección coronal de un embrión de E16.5 electroporado con PCIC en E15.5. Aquí, la acumulación de células positivas para mCherry es específica de la capa neuroblástica externa y no se observa en las células ganglionares retinianas positivas para B rrn3B en la capa de células ganglionares. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en 30 minutos si no surgen complicaciones inesperadas.

Al intentar este procedimiento, es importante utilizar técnicas estériles adecuadas, tener una mano firme al manipular los embriones y contar con todos los materiales necesarios preparados antes de anestesiar a la hembra preñada. Tras este procedimiento, los embriones electroencebollados pueden dejarse vivir hasta la edad adulta, momento en el cual se pueden realizar otros métodos, como ensayos conductuales y funcionales, para responder preguntas adicionales sobre cómo la manipulación de ciertos genes en el embrión afecta la función neuronal en el adulto. Desde su desarrollo, esta técnica ha allanado el camino para que investigadores en el campo del desarrollo del SNC exploren la función génica in vivo en ratón.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo introducir ADN foráneo en el tubo neural embrionario. En particular, le mostramos cómo preparar a una hembra preñada para la cirugía, exponer el útero, inyectar ADN y aplicar electroporación al embrión.

No olvide que trabajar con fluoruro de isoflurano puede ser peligroso, y se deben tomar precauciones como un sistema de eliminación de gases mientras se realiza este procedimiento.