El estudio de dependientes de la edad de Inestabilidad Genómica con el S. cerevisiae Cronológica Modelo Longevidad

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la inestabilidad genómica dependiente de la edad en levaduras combinando la longevidad cronológica con un conjunto de ensayos sencillos de daño y mutación del ADN. Esto se logra primero tomando muestras de cultivos en envejecimiento cronológico cada dos días y verificando la viabilidad mediante la formación de unidades formadoras de colonias o UFC. El siguiente paso del procedimiento consiste en examinar las mutaciones del ADN tomando muestras de cultivos envejecidos y sembrando las células en un medio de selección específico para mutaciones.

Finalmente, se pueden obtener resultados que muestren cambios en las mutaciones del ADN durante el envejecimiento cronológico de la levadura mediante la normalización de los resultados del ensayo de mutación respecto a la viabilidad. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del envejecimiento, como los mecanismos que vinculan el envejecimiento y la inestabilidad genómica en *aria*. Para determinar la longevidad cronológica de la levadura o CLS, primero inocule una colonia individual de levadura en un mililitro de medio glucosa sintético completo, o medio SDC, e incube durante la noche con agitación a 30 grados Celsius. Al día siguiente, diluya el cultivo nocturno en 10 mililitros de medio SDC fresco hasta un OD 600 de 0,05 a 0,1 e incube con agitación a 30 grados Celsius durante tres días.

El tercer día, cuando las células se encuentran en fase estacionaria, diluya cada Eloqua 10 000 veces en agua autoclavada, luego retire dos alícuotas de 10 microlitros del matraz y siembre 10 microlitros de cada cultivo diluido en una placa A-Y-E-P-D. Incube la placa a 30 grados Celsius hasta que aparezcan colonias. El número de colonias formadas, o unidades formadoras de colonias, provenientes del cultivo del tercer día se considera un 100 % de supervivencia.

Continúe retirando alícuotas del cultivo en envejecimiento durante los días siguientes para su siembra. Ajuste los factores de dilución en consecuencia para asegurar aproximadamente entre 20 y 100 colonias en el ensayo de UFC. Detenga el muestreo cuando la viabilidad del cultivo haya disminuido por debajo del 1 %; típicamente entre los días 11 y 13, la viabilidad celular también puede estudiarse en células envejecidas en placas.

Para comenzar este ensayo, inocular una colonia única en un mililitro de medio glucosado sintético completo y incubar durante la noche con agitación a 30 grados Celsius. Cuando el cultivo haya crecido hasta aproximadamente 10 a la octava células por mililitro, diluir el cultivo con agua de autoclave a 100-200 células por 10 microlitros y 1000 células por 10 microlitros. Para cada cepa, preparar un conjunto de ocho a veinte placas SDC con deficiencia de triptófano etiquetadas según la densidad de siembra.

Para asegurar que se puedan contar entre 10 y 100 colonias, anticipando la disminución de viabilidad durante el envejecimiento, plaque dos alícuotas de 10 a 30 microlitros de cultivo diluido en cada placa. Incube el conjunto de placas a 30 grados Celsius durante el análisis de longevidad: el día del plaqueo y cada dos días posteriormente, retire una placa y agregue gota a gota 0,5 mililitros de triptofano para permitir que las células viables crezcan. Incube la placa a 30 grados Celsius durante 48 a 72 horas adicionales.

Después de 48 a 72 horas, cuente las UFC para evaluar la viabilidad del día de la adición de triptófano, con el fin de analizar el daño al ADN y la frecuencia de mutación durante el envejecimiento cronológico. Se cultivan en paralelo varios cepas con características especiales junto con la cepa silvestre para el ensayo de longevidad cronológica de levaduras.

La frecuencia de mutación espontánea puede evaluarse midiendo la frecuencia de resistencia a la canavanina en un cultivo que envejece cronológicamente. Las mutaciones en el gen *can1*, que codifica la permeasa plasmática de arginina, confieren a las células resistencia al análogo de arginina L-canavanina; las células resistentes a canavanina crecerán en placas de medio sintético completo sin arginina suplementadas con sulfato de L-canavanina. La medición de la frecuencia de reversión a trip+ en una cepa que contiene una mutación *amber* en el gen *trp1* permite estimar la tasa de sustitución de bases durante el envejecimiento cronológico de la levadura.

Las células con reversiones positivas crecerán en placas de selección sin triptófano. La cepa lisogénica negativa EH uno 50 posee un corrimiento de lectura de más cuatro en el marco de lectura abierto, lo que provoca auxotrofia para lisina, y esto puede revertirse mediante pequeñas inserciones o deleciones. Los revertidos serán seleccionados en placas de selección sin lisina para detectar reordenamientos cromosómicos groseros o gcr.

Se utiliza una cepa mutante en la que HX T 13, ubicado a 7,5 kilobases telomérico respecto a can uno en el cromosoma cinco, está interrumpido por un casete U tres. Las mutaciones en ambos genes, can uno y U tres, hacen que las células sean resistentes a L-canavanina y ácido 5-fluoroorótico, respectivamente. Dado que la frecuencia de mutaciones puntuales que ocurren en ambos genes es baja, el análisis de la frecuencia de resistencia tanto a L-canavanina como al ácido 5-fluoroorótico proporciona una estimación de GCR. Para monitorear el nivel de recombinación homóloga y no homóloga, durante el envejecimiento cronológico se generan mutantes que portan repeticiones invertidas homólogas al 100 % o al 91 % homólogas.

La recombinación entre los IRS en el locus his tres permite la expresión de la proteína his tres funcional. Por lo tanto, las células en las que ha ocurrido la recombinación crecerán en placas sin histidina suplementadas con galactosa. En el día tres, cuando las células se encuentren en fase estacionaria, se retirará una cantidad adecuada de células de cada cultivo envejecido.

Dado que se utiliza el mismo procedimiento para todos los ensayos, solo se procesará una muestra. A efectos de este video, centrifugue las células en una centrífuga de banco para formar el pellet. Retire el sobrenadante y resuspenda las células en un mililitro de agua esterilizada en autoclave.

Nuevamente, elimine el sobrenadante y resuspenda el botón celular en 100 microlitros de agua. Plaque las células en las placas adecuadas para seleccionar los revertidos deseados. Incube las placas a 30 grados Celsius y, tras tres o cuatro días, cuente las UFC; la frecuencia de mutación se normaliza respecto al número de células viables. Este gráfico muestra resultados representativos de un ensayo típico de longevidad cronológica cuando se compara la supervivencia cronológica de células silvestres con la de los mutantes S CH nueve delta TOR uno delta y RAs dos delta.

En cultivos líquidos, los mutantes que carecen de TOR uno s, CH nueve o RAs dos muestran una longevidad cronológica prolongada. Además, las deficiencias en s CH nueve y RAs dos muestran un efecto aditivo en la promoción de la supervivencia cronológica en presencia de diversas fuentes de carbono. Mediante el ensayo de viabilidad NC dos se muestra en este siguiente gráfico.

El día uno, los cultivos silvestres de SDC se diluyeron y sembraron en placas SC de triple ausencia sin fuente de carbono. Las placas SC de triple ausencia suplementadas con glucosa, etanol o glicerol se incubaron a 30 grados Celsius, revisándose cada dos días. Se recuperó una placa de cada conjunto y se agregaron los nutrientes apropiados para permitir el crecimiento y la formación de colonias.

La frecuencia de mutación dependiente de la edad varía considerablemente según la cepa, el fondo genético, la manipulación genética, el cultivo, las condiciones y la edad. Esta tabla muestra los resultados típicos obtenidos en una cepa silvestre. Los resultados representativos de la síntesis translesión se muestran en la siguiente imagen.

El aumento de la frecuencia de mutaciones dependiente de la edad puede implicar cambios en la reparación errónea del ADN utilizando extractos nucleares y diversas plantillas de ADN. Podemos evaluar la síntesis de translesión o TLS en células envejecidas cronológicamente. Se analizaron extractos nucleares de células de fase estacionaria de tres días de edad, de tipo silvestre y del mutante SCH nueve delta.

Los productos de TLS con plantilla no dañada se indican mediante líneas continuas y los productos de TLS con plantilla dañada se indican mediante líneas punteadas. No se observó síntesis translesión en extractos nucleares del mutante de larga duración s CH nueve delta; los cebadores libres se indican mediante la flecha abierta. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo realizar el análisis de longevidad cronológica y de mutación del ADN en levaduras.