La visualización de ADN recombinante y complejos de proteínas utilizando microscopía de fuerza atómica

El objetivo general de este procedimiento es obtener imágenes de biomoléculas como el ADN y las proteínas en tampones acuosos en tiempo real mediante microscopía de fuerza atómica. Esto se logra primero preparando las biomoléculas que se van a imaginar. A continuación, se configura el microscopio de fuerza atómica y se posiciona una sonda de palanca en modo de frecuencia modulada (FM).

Posteriormente, se realiza la imagen y el análisis de la superficie de la muestra y de las biomoléculas de interés. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestren el tamaño general, la cantidad y la organización del ADN, las proteínas y los complejos biomoleculares heterogéneos en condiciones tamponadas mediante microscopía de fuerza atómica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de las chaperonas moleculares, como cuál es la geometría EST de los complejos formados por chaperonas, co-chaperonas y sus sustratos.

La demostración visual de este método es beneficiosa, ya que los pasos de preparación de la sonda de palanca A FM y Kent pueden ser difíciles de aprender a partir de instrucciones impresas, principalmente debido a las complejidades asociadas con su manipulación física. La demostración del procedimiento estará a cargo de Morgan Shannon y John Gertz, dos estudiantes de mi laboratorio. Para comenzar, aísle las moléculas de proteína o ADN que se van a imaginar y suspéndalas en un tampón acuoso. Después de confirmar la pureza de la muestra, incúbela en un tampón de absorción a FM sobre hielo para favorecer la adherencia de la muestra a la mica.

Para muestras de proteínas, utilice un tampón heaps de 10 milimolares. Y para ADN, un tampón que contenga magnesio compuesto de 10 milimolares de tris, pH 7,5, 10 milimolares de cloruro de sodio y 2 milimolares de cloruro de magnesio es adecuado para montar la sonda de MF. Coloque el soporte de la sonda con celda líquida en la estación de acoplamiento correspondiente para la instalación del cantilever.

Localice el cantiléver largo y grueso de la sonda de palanca de nitruro afilada que se utilizará para la imagen. Transfiera cuidadosamente la sonda al soporte de sonda para celda líquida, asegurándose de que la punta permanezca en posición vertical. A continuación, examine el cantiléver bajo un microscopio óptico para verificar que esté intacto y correctamente colocado en el soporte de sonda para celda líquida.

Luego, retire cuidadosamente la cabeza de FM del ensamblaje de cola de milano del instrumento apretando el tornillo de sujeción de la cabeza neural. Invierta la cabeza de FM y presione firmemente el soporte de la sonda de la celda líquida sobre los cuatro pines en la base de la cabeza de FM. Finalmente, devuelva cuidadosamente la cabeza de FM al ensamblaje de cola del instrumento.

Para preparar aún más el microscopio de fuerza atómica (FM) antes de imaginar las muestras, mueva los controles del microscopio óptico integrado para localizar la punta del cantiléver y ajuste las flechas arriba y abajo del controlador óptico en el software para enfocar la punta del cantiléver. Utilice los controles de ajuste del láser para alinear el haz láser con la punta del cantiléver. Este es uno de los pasos técnicamente más desafiantes del protocolo; la posición se realiza manualmente y requiere ajustes precisos de los controles.

El monitoreo cuidadoso del láser en el punto de reflexión y en el punto de iluminación aumenta la probabilidad de un alineado exitoso. A continuación, ajuste los mandos del fotodetector en la cabeza de FM para centrar el fotodetector. Coloque una lámina recién fracturada de MICA, sujeta a un disco metálico de muestra de FM, sobre el portamuestras magnetizado situado encima de la placa del portamuestras de FM.

Gire la placa portadora de FM para que el disco de muestra quede posicionado para la imagen inicial. Utilice el control de superficie de enfoque del software del instrumento para mover la cabeza de FM hacia abajo, en dirección a la superficie del disco de muestra MICA. Hasta que características distintivas en la superficie de MICA o el reflejo de la punta estén enfocadas, seleccione el icono de ajuste en el software del instrumento y sintonice el cantiléver.

La frecuencia de resonancia de las sondas MSNL o SNL recomendadas es de 20 a 60 kilohercios. Seleccione un desplazamiento pico del 5 % para obtener una imagen de la muestra MICA. En primer lugar, acople la sonda sobre la superficie de MICA, establezca un tamaño de escaneo inicial de 10 micrómetros y una velocidad de escaneo de un hercio.

Capture imágenes completas de escaneo del campo de 10 micrómetros. Luego reduzca el tamaño de escaneo a cinco, uno y 0,5 micrómetros y capture imágenes completas de cada campo. Desacople la sonda haciendo clic una vez en el icono de desacoplamiento en el software del instrumento.

Para obtener imágenes de las biomoléculas de interés, mezcle cinco microlitros de la muestra preparada con 45 microlitros de tampón de absorción fresco. Añada cuidadosamente 50 microlitros de la solución que contiene la biomolécula a 0,5 microgramos por mililitro directamente sobre la superficie de los MICUs. Espere cinco minutos para permitir que las biomoléculas de la muestra se adhieran a la superficie de Micah.

Luego, pipetee un volumen adicional de 50 a 100 microlitros de tampón de absorción en el porta-probeta de celda líquida. Teniendo cuidado de no tocar la probeta, una cabeza FM o MICA con la punta de la pipeta, reajuste el detector de fotos y realinee el láser con el cantilever según sea necesario. A continuación, use el software del instrumento para volver a acoplar la probeta.

Aumente el tamaño de escaneo para identificar las regiones de interés. Una vez finalizada la adquisición de imágenes, seleccione varias veces el icono de retiro en el software del instrumento para desacoplar la sonda. Finalmente, use agua destilada para enjuagar completamente el portaondas de la sonda de la celda líquida y el disco de la muestra.

Luego pruébelo con aire comprimido. A continuación se muestra un ejemplo de una imagen de FM-A. El sustrato de mica proporciona una superficie molecularmente plana sobre la cual pueden absorber el ADN y las proteínas.

La imagen de MICA antes de las muestras de biomoléculas proporciona un control negativo y una evaluación del ruido de imagen. También ofrece un nivel de certeza de que el cantilever está correctamente ajustado y de que el posterior análisis de imagen de la muestra será exitoso. El ADN plasmático de doble cadena presumiblemente superenrollado se identifica fácilmente por su apariencia asimétrica y su depósito uniforme sobre el sustrato de Micah previamente sin características notables.

Los complejos proteicos de tamaños de partículas discretos también son fácilmente distinguibles del sustrato Micah. Las diferencias en el tamaño de las partículas indican heterogeneidad de la muestra y pueden ser útiles para aproximar la estequiometría, la geometría estructural o la actividad bioquímica de la proteína. La forma diagonal general y la orientación constante de las partículas proteicas observadas.

Aquí hay un artefacto de imagen, ya que se esperaría que las proteínas estuvieran orientadas sobre el sustrato Micah de forma aleatoria. Las posibles causas del artefacto observado son una anormalidad física del punzón o una imagen FM a dos velocidades rápidas de barrido, mientras que la convolución del punzón impide los cálculos de medición absoluta de longitud en los ejes X e Y, o de altura en el eje Z; sin embargo, las mediciones relativas en X e Y pueden ser útiles para estimar las propiedades biofísicas de las biomoléculas imagenadas. Al llevar a cabo este procedimiento, es importante recordar ajustar con precisión el cantiléver y alinear el detector fotónico siguiendo este procedimiento básico de FM.

Se pueden agregar otros pasos, como el uso de una celda de fluido para intercambio de tampón, con el fin de responder preguntas adicionales, tales como la capacidad de las chaperonas moleculares para afectar la liberación de receptores esteroideos de sus elementos de respuesta en el ADN. Después de ver este video, debería tener una mejor comprensión de cómo obtener imágenes de proteínas del ADN y complejos biomoleculares utilizando microscopía de fuerza atómica en condiciones tamponadas.